| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 1 前言 | 第9-17页 |
| 1.1 黑曲霉的应用价值及潜在危害 | 第9页 |
| 1.2 途径调控因子调控真菌次级代谢的研究进展 | 第9-10页 |
| 1.2.1 碳信号调控因子creA | 第9-10页 |
| 1.2.2 pH信号调控因子pacC | 第10页 |
| 1.2.3 氮信号调控因子areA | 第10页 |
| 1.2.4 氧胁迫调控因子yap1 | 第10页 |
| 1.3 全局调控因子VelB/VeA/LaeA复合体的发现及研究 | 第10-13页 |
| 1.3.1 调控真菌发育及繁殖 | 第11-12页 |
| 1.3.2 调控丝状真菌次级代谢 | 第12页 |
| 1.3.3 VelB/VeA/LaeA复合物受光调控 | 第12-13页 |
| 1.4 活性氧的种类与微生物的氧化应激 | 第13-14页 |
| 1.4.1 活性氧的种类 | 第13-14页 |
| 1.4.2 微生物应对氧化胁迫的机制 | 第14页 |
| 1.5 全局调控因子调控菌体应对氧化胁迫的损伤 | 第14-15页 |
| 1.6 本课题的研究意义及主要研究内容 | 第15-17页 |
| 1.6.1 本论文的研究意义 | 第15-16页 |
| 1.6.2 主要研究内容 | 第16-17页 |
| 2 材料与方法 | 第17-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第17-23页 |
| 2.1.1 主要试剂 | 第17页 |
| 2.1.2 引物 | 第17-18页 |
| 2.1.3 仪器和设备 | 第18-19页 |
| 2.1.4 试剂、溶液与培养基 | 第19-23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-44页 |
| 2.2.1 黑曲霉基因组提取方法 | 第23页 |
| 2.2.2 veA基因的克隆及测序 | 第23-24页 |
| 2.2.3 laeA基因的克隆及测序 | 第24-25页 |
| 2.2.4 veA基因敲除质粒的构建 | 第25-29页 |
| 2.2.5 laeA基因敲除质粒的构建 | 第29-32页 |
| 2.2.6 T载体和片段的连接 | 第32-33页 |
| 2.2.7 大肠感受态的制备与化转 | 第33页 |
| 2.2.8 质粒的提取 | 第33页 |
| 2.2.9 农杆菌感受态的制备及电转 | 第33-34页 |
| 2.2.10 根癌农杆菌与黑曲霉A14共培养 | 第34-35页 |
| 2.2.11 黑曲霉转化子的初筛 | 第35页 |
| 2.2.12 黑曲霉转化子的复筛 | 第35页 |
| 2.2.13 黑曲霉转化子的验证 | 第35-39页 |
| 2.2.14 veA及laeA基因缺失转化子的重测序验证 | 第39页 |
| 2.2.15 veA及laeA基因缺失菌株的遗传稳定性验证 | 第39页 |
| 2.2.16 黑曲霉RNA的提取及qRT-PCR | 第39-41页 |
| 2.2.17 菌落生长直径的测定 | 第41页 |
| 2.2.18 产孢量分析 | 第41页 |
| 2.2.19 黑曲霉A14、ΔveA和ΔlaeA菌丝形态观察 | 第41页 |
| 2.2.20 扫描电子显微镜观察分生孢子的形态差异 | 第41-42页 |
| 2.2.21 黑曲霉A14、ΔveA和ΔlaeA代谢物测定 | 第42页 |
| 2.2.22 H_2O_2对黑曲霉A14及突变株生长影响 | 第42页 |
| 2.2.23 粗提液的制备及蛋白含量的测定 | 第42页 |
| 2.2.24 菌体胞内ROS水平的检测 | 第42-43页 |
| 2.2.25 菌体脂质过氧化的水平(MDA)的测定 | 第43页 |
| 2.2.26 菌体胞内抗氧化酶活性测定 | 第43-44页 |
| 3 结果和讨论 | 第44-76页 |
| 3.1 黑曲霉A14 veA基因的克隆及敲除载体的构建 | 第44-48页 |
| 3.1.1 黑曲霉A14 veA基因的克隆 | 第44页 |
| 3.1.2 黑曲霉A14 veA基因的测序及比对结果 | 第44-45页 |
| 3.1.3 黑曲霉A14 veA基因同源左右臂克隆 | 第45页 |
| 3.1.4 黑曲霉A14 veA基因同源左右臂测序及比对 | 第45页 |
| 3.1.5 黑曲霉A14 veA基因敲除质粒的构建及验证 | 第45-48页 |
| 3.2 黑曲霉A14 laeA基因的克隆及敲除载体的构建 | 第48-52页 |
| 3.2.1 黑曲霉A14 laeA基因的克隆 | 第48页 |
| 3.2.2 黑曲霉A14 laeA基因的测序及比对结果 | 第48-49页 |
| 3.2.3 黑曲霉A14 laeA基因同源左右臂克隆 | 第49页 |
| 3.2.4 黑曲霉A14 laeA基因同源左右臂测序及比对 | 第49页 |
| 3.2.5 黑曲霉A14 laeA基因敲除质粒的构建及验证 | 第49-52页 |
| 3.3 黑曲霉A14对潮霉素敏感性实验 | 第52页 |
| 3.4 黑曲霉A14 veA及laeA基因缺失菌株的获得 | 第52-57页 |
| 3.4.1 敲除质粒电转农杆菌AGL-1 | 第52-53页 |
| 3.4.2 携带有敲除质粒的农杆菌侵染黑曲霉及转化子的筛选结果 | 第53-57页 |
| 3.5 重测序及hyg插入位点的确定 | 第57-58页 |
| 3.5.1 黑曲霉A14 veA基因缺失菌株hyg插入位点的确定 | 第57-58页 |
| 3.5.2 黑曲霉A14 laeA基因缺失菌株hyg插入位点的确定 | 第58页 |
| 3.6 黑曲霉A14 veA及laeA基因缺失菌株遗传稳定性验证 | 第58-59页 |
| 3.7 黑曲霉A14 veA及laeA基因缺失菌株表型分析 | 第59-63页 |
| 3.7.1 菌落表型直径及产孢的比较 | 第59-61页 |
| 3.7.2 光学显微镜下菌丝的比较 | 第61-62页 |
| 3.7.3 扫描电子显微镜下孢子形态的比较 | 第62-63页 |
| 3.8 黑曲霉A14 veA及laeA基因缺失菌株产毒分析 | 第63-65页 |
| 3.8.1 OTβ、OTα和OTA的检测 | 第63-64页 |
| 3.8.2 OTβ、OTα和OTA的动力学分析 | 第64-65页 |
| 3.9 氧化胁迫对黑曲霉A14、ΔveA及ΔlaeA生长的影响 | 第65-67页 |
| 3.9.1 H_2O_2胁迫下对黑曲霉A14生长结果 | 第65-66页 |
| 3.9.2 H_2O_2胁迫下对ΔveA生长结果 | 第66-67页 |
| 3.9.3 H_2O_2胁迫下对ΔlaeA生长结果 | 第67页 |
| 3.10 氧化胁迫对黑曲霉A14、ΔveA及ΔlaeA菌株OTA的合成、胞内ROS、脂质过氧化及抗氧化酶活性的影响 | 第67-75页 |
| 3.10.1 H_2O_2胁迫对黑曲霉A14 OTA合成的影响 | 第68页 |
| 3.10.2 H_2O_2胁迫对菌株胞内ROS含量的影响 | 第68-71页 |
| 3.10.3 H_2O_2胁迫对菌株胞内MDA含量的影响 | 第71-72页 |
| 3.10.4 H_2O_2胁迫对菌株胞内抗氧化酶活性的影响 | 第72-75页 |
| 3.11 黑曲霉A14、ΔveA菌株中OTA生物合成关键基因pks的表达分析 | 第75-76页 |
| 4 结论 | 第76-78页 |
| 4.1 全文总结 | 第76-77页 |
| 4.2 不足与展望 | 第77-78页 |
| 5 参考文献 | 第78-84页 |
| 6 致谢 | 第84-85页 |
| 7 攻读硕士期间发表的论文 | 第85-86页 |
| 8 附录 | 第86-89页 |
