| 中文摘要 | 第3-5页 |
| 英文摘要 | 第5-6页 |
| 英文缩略词对照表 | 第12-15页 |
| 1 绪论 | 第15-27页 |
| 1.1 骨肉瘤化疗与耐药 | 第15-24页 |
| 1.1.1 骨肉瘤 | 第15页 |
| 1.1.2 耐药的产生 | 第15-16页 |
| 1.1.3 基因调控 | 第16-17页 |
| 1.1.4 siRNA在耐药中的作用 | 第17-18页 |
| 1.1.5 siRNA文库的概述 | 第18-19页 |
| 1.1.6 全基因组siRNA文库的介绍 | 第19-24页 |
| 1.2 课题的研究目的与意义 | 第24页 |
| 1.3 课题的研究内容 | 第24-25页 |
| 1.3.1 主要内容 | 第24页 |
| 1.3.2 技术路线 | 第24-25页 |
| 1.4 课题的特色及创新点 | 第25-27页 |
| 2 应用全基因组siRNA文库质粒构建n19-SJSA1-Nutlin3a耐药株 | 第27-47页 |
| 2.1 前言 | 第27-28页 |
| 2.1.1 SJSA1细胞及其特性 | 第27页 |
| 2.1.2 Nutlin3a药物简介及其作用机理 | 第27-28页 |
| 2.2 实验仪器,材料与试剂 | 第28-30页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第28页 |
| 2.2.2 材料与试剂 | 第28-30页 |
| 2.3 实验方法 | 第30-39页 |
| 2.3.1 细胞培养 | 第30页 |
| 2.3.2 药物处理 | 第30-31页 |
| 2.3.3 包装逆转录病毒 | 第31页 |
| 2.3.4 文库刺激产生耐药细胞株 | 第31-32页 |
| 2.3.5 总RNA的提取及检测 | 第32页 |
| 2.3.6 RNA反转录 | 第32-33页 |
| 2.3.7 qRT-PCR基因检测 | 第33-34页 |
| 2.3.8 提取基因组DNA | 第34-35页 |
| 2.3.9 扩增并回收P53基因突变热点序列 | 第35-36页 |
| 2.3.10 构建pMOK-P53质粒 | 第36-38页 |
| 2.3.11 质粒测序 | 第38-39页 |
| 2.4 实验结果 | 第39-44页 |
| 2.4.1 检测Nutlin3a对SJSA1细胞株的致死剂量 | 第39-40页 |
| 2.4.2 在不同时间点收集siRNA文库逆转录病毒 | 第40-41页 |
| 2.4.3 SJSA1耐药细胞株的建立 | 第41-42页 |
| 2.4.4 亲代细胞株和耐药细胞株P53基因型鉴定 | 第42-43页 |
| 2.4.5 肿瘤耐药相关基因在耐药细胞中的表达 | 第43-44页 |
| 2.5 讨论 | 第44-45页 |
| 2.6 本章小结 | 第45-47页 |
| 3 Nutlin3a药物处理对耐药细胞株增殖,凋亡及细胞周期的影响 | 第47-67页 |
| 3.1 前言 | 第47页 |
| 3.2 实验仪器,材料与试剂 | 第47-49页 |
| 3.2.1 实验仪器 | 第47-48页 |
| 3.2.2 材料与试剂 | 第48-49页 |
| 3.3 实验方法 | 第49-54页 |
| 3.3.1 细胞培养 | 第49页 |
| 3.3.2 药物处理 | 第49-50页 |
| 3.3.3 结晶紫染色 | 第50页 |
| 3.3.4 WST-1检测 | 第50页 |
| 3.3.5 Hoechst染色 | 第50-51页 |
| 3.3.6 免疫荧光 | 第51页 |
| 3.3.7 总RNA的提取及检测 | 第51-52页 |
| 3.3.8 RNA反转录 | 第52页 |
| 3.3.9 qRT-PCR基因检测 | 第52-53页 |
| 3.3.10 流式细胞仪检测细胞周期 | 第53-54页 |
| 3.4 实验结果 | 第54-63页 |
| 3.4.1 检测耐药细胞株和亲代细胞株的耐药性 | 第54-56页 |
| 3.4.2 检测耐药细胞株和亲代细胞株的半数致死剂量 | 第56-57页 |
| 3.4.3 不同浓度Nutlin3a处理后细胞中凋亡小体的形成 | 第57-58页 |
| 3.4.4 不同药物浓度及处理时间对细胞中凋亡通路相关基因表达的影响 | 第58-59页 |
| 3.4.5 不同浓度的Nutlin3a对cleavedcaspase-3蛋白表达的影响 | 第59-60页 |
| 3.4.6 不同药物浓度及处理时间对细胞中P53和MDM2,及细胞周期相关基因表达的影响 | 第60-61页 |
| 3.4.7 Nutlin3a对亲代及耐药细胞株细胞周期的调控 | 第61-63页 |
| 3.5 讨论 | 第63-64页 |
| 3.6 本章小结 | 第64-67页 |
| 4 耐药细胞株的EMT效应及药物敏感性的变化 | 第67-87页 |
| 4.1 前言 | 第67页 |
| 4.1.1 EMT与肿瘤耐药 | 第67页 |
| 4.2 实验仪器,材料与试剂 | 第67-69页 |
| 4.2.1 实验仪器 | 第67-68页 |
| 4.2.2 材料与试剂 | 第68-69页 |
| 4.3 实验方法 | 第69-78页 |
| 4.3.1 细胞培养 | 第69-70页 |
| 4.3.2 药物处理 | 第70页 |
| 4.3.3 总RNA的提取及检测 | 第70页 |
| 4.3.4 RNA反转录 | 第70-71页 |
| 4.3.5 基因检测 | 第71-73页 |
| 4.3.6 划线迁移 | 第73页 |
| 4.3.7 结晶紫染色 | 第73页 |
| 4.3.8 MTT检测细胞增殖 | 第73-74页 |
| 4.3.9 Westernblot | 第74-78页 |
| 4.4 实验结果 | 第78-84页 |
| 4.4.1 EMT相关基因在耐药细胞株里的表达 | 第78-79页 |
| 4.4.2 耐药细胞株的迁移性的检测 | 第79-80页 |
| 4.4.3 耐药细胞株对其他肿瘤药物敏感性的变化 | 第80-82页 |
| 4.4.4 雌二醇处理对细胞增殖,MDM2及hnRNPA1表达的影响 | 第82-84页 |
| 4.5 讨论 | 第84-85页 |
| 4.6 本章小结 | 第85-87页 |
| 5 耐药细胞株n19-SJSA1-Nutlin3a基因组的高通量测序 | 第87-99页 |
| 5.1 前言 | 第87页 |
| 5.2 实验仪器,材料与试剂 | 第87-89页 |
| 5.2.1 实验仪器 | 第87-88页 |
| 5.2.2 材料与试剂 | 第88-89页 |
| 5.3 实验方法 | 第89-92页 |
| 5.3.1 细胞培养 | 第89页 |
| 5.3.2 药物处理 | 第89页 |
| 5.3.3 文库刺激产生耐药细胞株 | 第89-90页 |
| 5.3.4 细胞基因组DNA的提取 | 第90页 |
| 5.3.5 gDNA的PCR扩增 | 第90-92页 |
| 5.3.6 IlluminaHiSeq | 第92页 |
| 5.4 实验结果 | 第92-96页 |
| 5.4.1 gDNAPCR | 第92-94页 |
| 5.4.2 IlluminaHiSeq富集片段含量分析 | 第94-96页 |
| 5.5 讨论 | 第96-97页 |
| 5.6 本章小结 | 第97-99页 |
| 6 挑选富集片段构建稳定过表达细胞株及其耐药机制的初步研究 | 第99-145页 |
| 6.1 前言 | 第99页 |
| 6.2 实验仪器,材料与试剂 | 第99-102页 |
| 6.2.1 实验仪器 | 第99-100页 |
| 6.2.2 材料与试剂 | 第100-102页 |
| 6.3 实验方法 | 第102-111页 |
| 6.3.1 细胞培养 | 第102页 |
| 6.3.2 药物处理 | 第102页 |
| 6.3.3 质粒构建 | 第102-104页 |
| 6.3.4 质粒测序 | 第104-105页 |
| 6.3.5 逆转录病毒包装 | 第105-106页 |
| 6.3.6 腺病毒载体构建与包装 | 第106页 |
| 6.3.7 结晶紫染色 | 第106-107页 |
| 6.3.8 生物信息学分析 | 第107页 |
| 6.3.9 总RNA的提取及检测 | 第107页 |
| 6.3.10 RNA反转录 | 第107-108页 |
| 6.3.11 基因检测 | 第108-111页 |
| 6.3.12 siRNA转染 | 第111页 |
| 6.4 实验结果 | 第111-140页 |
| 6.4.1 单一富集片段的逆转录病毒的获得 | 第111-113页 |
| 6.4.2 细胞株稳定过表达单一序列后产生耐药性的检测 | 第113-114页 |
| 6.4.3 Mix片段逆转录病毒和腺病毒的获得 | 第114-116页 |
| 6.4.5 不同种类稳定细胞株过表达单一富集片段和Mix片段后产生耐药性的检测 | 第116-117页 |
| 6.4.6 靶向基因的生物信息学初步分析 | 第117-129页 |
| 6.4.7 qPCR检测靶向基因在亲代细胞株和耐药细胞株中表达差异 | 第129-136页 |
| 6.4.8 沉默表达差异明显的基因并检测其耐药性的变化 | 第136-140页 |
| 6.5 讨论 | 第140-142页 |
| 6.6 本章小结 | 第142-145页 |
| 7 结论与展望 | 第145-149页 |
| 7.1 主要结论 | 第145-146页 |
| 7.2 后续工作展望 | 第146-149页 |
| 致谢 | 第149-151页 |
| 参考文献 | 第151-163页 |
| 附录 | 第163-165页 |
