| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 引言 | 第12-20页 |
| 1.1 漆酶 | 第12-14页 |
| 1.1.1 漆酶的分类和功能 | 第12-13页 |
| 1.1.2 漆酶的结构和催化机制 | 第13页 |
| 1.1.3 漆酶的分离纯化 | 第13-14页 |
| 1.2 漆酶的应用 | 第14-16页 |
| 1.2.1 造纸和纺织方面的应用 | 第14-15页 |
| 1.2.2 生物修复和生物降解方面的应用 | 第15页 |
| 1.2.3 食品加工方面的应用 | 第15页 |
| 1.2.4 漆酶在医学工业中的应用 | 第15页 |
| 1.2.5 其他方面的应用 | 第15-16页 |
| 1.3 漆酶的研究进展 | 第16-17页 |
| 1.3.1 漆酶基因的克隆 | 第16页 |
| 1.3.2 漆酶基因的异源表达 | 第16-17页 |
| 1.4 漆酶表达的影响因素 | 第17-19页 |
| 1.4.1 信号肽 | 第17页 |
| 1.4.2 启动子 | 第17-18页 |
| 1.4.3 漆酶基因 | 第18页 |
| 1.4.4 培养条件 | 第18页 |
| 1.4.5 密码子优化对基因表达的影响 | 第18-19页 |
| 1.5 本研究的目的及意义 | 第19-20页 |
| 第二章 特异腐质霉来源漆酶基因的克隆和表达 | 第20-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-22页 |
| 2.1.1 质粒与菌株 | 第20页 |
| 2.1.2 工具酶与试剂 | 第20页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第20-21页 |
| 2.1.4 相关溶液的配置 | 第21-22页 |
| 2.2 实验方法 | 第22-30页 |
| 2.2.1 基因cDNA的获得 | 第22页 |
| 2.2.2 Lac1基因克隆 | 第22-23页 |
| 2.2.3 PCR产物回收 | 第23页 |
| 2.2.4 Lac1基因重组克隆载体的构建 | 第23-24页 |
| 2.2.5 大肠杆菌Mach感受态制备 | 第24页 |
| 2.2.6 将连接体系转化克隆菌株Mach | 第24-25页 |
| 2.2.7 提取质粒 | 第25页 |
| 2.2.8 测序正确的重组质粒和表达载体酶切 | 第25页 |
| 2.2.9 酶切产物回收 | 第25-26页 |
| 2.2.10 漆酶基因与表达载体连接 | 第26页 |
| 2.2.11 重组表达体系转入克隆菌株 | 第26页 |
| 2.2.12 重组质粒pET30a-Lac1转入表达菌株BL21(DE3) | 第26页 |
| 2.2.13 大肠杆菌中蛋白的诱导表达及纯化 | 第26-27页 |
| 2.2.14 漆酶的酶活测定 | 第27页 |
| 2.2.15 重组表达载体pPIC9r-lac1的线性化制备 | 第27-28页 |
| 2.2.16 酵母感受态GS115的制备 | 第28页 |
| 2.2.17 电击转化 | 第28页 |
| 2.2.18 重组酵母的诱导表达 | 第28页 |
| 2.2.19 重组酵母的PCR鉴定 | 第28-29页 |
| 2.2.20 表达产物的鉴定 | 第29页 |
| 2.2.21 发酵罐水平漆酶的表达 | 第29页 |
| 2.2.22 重组漆酶最适温度和最适pH测定 | 第29-30页 |
| 2.2.23 重组漆酶温度温度稳定性和pH稳定性测定 | 第30页 |
| 2.2.24 不同金属离子和化学试剂对重组漆酶酶活力的影响 | 第30页 |
| 2.3 实验结果 | 第30-38页 |
| 2.3.1 漆酶基因lac1的克隆及重组质粒的构建 | 第30-31页 |
| 2.3.2 漆酶基因lac1在大肠杆菌中的表达 | 第31-33页 |
| 2.3.3 重组酵母表达载体的构建以及筛选与鉴定 | 第33-34页 |
| 2.3.4 Lac1基因在毕赤酵母中的表达 | 第34-35页 |
| 2.3.5 3L发酵水平漆酶的表达 | 第35-36页 |
| 2.3.6 最适温度和温度稳定性 | 第36页 |
| 2.3.7 最适pH和pH稳定性测定 | 第36-37页 |
| 2.3.8 化学试剂和不同金属离子的耐受性 | 第37-38页 |
| 2.4 讨论 | 第38页 |
| 2.5 本章小结 | 第38-40页 |
| 第三章 漆酶的精氨酸稀有密码子的同义突变对表达量的影响 | 第40-48页 |
| 3.1 实验材料 | 第40-42页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第40页 |
| 3.1.2 工具酶与试剂 | 第40页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第40-41页 |
| 3.1.4 相关溶液的配置 | 第41页 |
| 3.1.5 引物 | 第41-42页 |
| 3.2 实验方法 | 第42-45页 |
| 3.2.1 漆酶突变体的构建 | 第42页 |
| 3.2.2 PCR模板质粒的提取 | 第42页 |
| 3.2.3 PCR扩增突变片段 | 第42-43页 |
| 3.2.4 PCR产物的DNA凝胶回收 | 第43页 |
| 3.2.5 两片段体外重组 | 第43页 |
| 3.2.6 大肠杆菌mach菌株感受态细胞的制备 | 第43-44页 |
| 3.2.7 将重组突变体体系转化大肠杆菌克隆菌株 | 第44页 |
| 3.2.8 阳性克隆子的筛选与验证 | 第44-45页 |
| 3.2.9 将突变体质粒转化大肠杆菌表达菌株 | 第45页 |
| 3.2.10 野生型和突变体在大肠杆菌中的诱导表达 | 第45页 |
| 3.2.11 突变体的酶活测定 | 第45页 |
| 3.3 实验结果 | 第45-47页 |
| 3.3.1 突变体的构建 | 第45-46页 |
| 3.3.2 突变体漆酶的酶活测定 | 第46-47页 |
| 3.3.3 突变体漆酶表达的SDS-PAGE | 第47页 |
| 3.4 讨论 | 第47页 |
| 3.5 本章小结 | 第47-48页 |
| 第四章 共表达分子伴侣对漆酶cueo在毕赤酵母中表达的影响 | 第48-54页 |
| 4.1 实验材料 | 第48-49页 |
| 4.1.1 菌株与质粒 | 第48页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第48页 |
| 4.1.3 培养基 | 第48-49页 |
| 4.2 实验方法 | 第49-51页 |
| 4.2.1 分子伴侣的质粒的提取 | 第49页 |
| 4.2.2 醇沉浓缩质粒 | 第49-50页 |
| 4.2.3 带有漆酶基因的酵母感受态的制备 | 第50页 |
| 4.2.4 电击转化分子伴侣质粒 | 第50页 |
| 4.2.5 筛选阳性克隆子质粒 | 第50页 |
| 4.2.6 重组蛋白的诱导表达 | 第50-51页 |
| 4.3 实验结果 | 第51-53页 |
| 4.3.1 共表达分子伴侣的筛选 | 第51页 |
| 4.3.2 共表达分子伴侣质粒的构建 | 第51页 |
| 4.3.3 共表达分子伴侣菌株的筛选 | 第51-52页 |
| 4.3.4 共表达分子伴侣对漆酶的影响 | 第52-53页 |
| 4.4 讨论 | 第53页 |
| 4.5 本章小结 | 第53-54页 |
| 第五章 全文总结及展望 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-60页 |
| 作者简历 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61页 |
