| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略词 | 第14-15页 |
| 第一章 引言 | 第15-29页 |
| 1.1 研究背景 | 第15-26页 |
| 1.1.1 植物次级代谢产物和萜类物质 | 第15-16页 |
| 1.1.2 倍半萜内酯 | 第16-17页 |
| 1.1.3 倍半萜内酯的合成途径 | 第17-19页 |
| 1.1.4 倍半萜内酯合成途径关键酶 | 第19-22页 |
| 1.1.5 苍耳简介 | 第22-23页 |
| 1.1.6 苍耳化学成分和功效 | 第23-24页 |
| 1.1.7 苍耳中倍半萜内酯合成部位 | 第24-25页 |
| 1.1.8 次级代谢产物合成途径上基因挖掘的方法 | 第25-26页 |
| 1.2 研究内容和意义 | 第26-29页 |
| 1.2.1 研究意义 | 第26页 |
| 1.2.2 研究内容 | 第26-29页 |
| 第二章 苍耳腺体细胞及其叶片转录组文库的建立 | 第29-65页 |
| 2.1 前言 | 第29-30页 |
| 2.2 实验材料 | 第30-31页 |
| 2.2.1 植物材料 | 第30页 |
| 2.2.2 本章所用的引物 | 第30-31页 |
| 2.2.3 分离腺毛的缓冲液 | 第31页 |
| 2.3 实验方法 | 第31-37页 |
| 2.3.1 倍半萜内酯的提取及检测 | 第31-32页 |
| 2.3.2 扫描电镜观察腺毛细胞方法 | 第32页 |
| 2.3.3 腺毛细胞提取方法 | 第32-33页 |
| 2.3.4 植物总RNA的提取 | 第33-35页 |
| 2.3.4.1 艾德莱EASYspin plus植物RNA快速提取试剂盒 | 第33-34页 |
| 2.3.4.2 TRIzol法提植物总RNA | 第34-35页 |
| 2.3.5 cDNA第一链的合成 | 第35页 |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR | 第35-36页 |
| 2.3.7 测序流程 | 第36-37页 |
| 2.4 实验结果 | 第37-55页 |
| 2.4.1 苍耳中倍半萜内酯化合物的测定 | 第37页 |
| 2.4.2 叶片和腺毛中倍半萜内酯含量比较 | 第37-39页 |
| 2.4.3 苍耳叶片表面腺毛细胞的观察和分离 | 第39-40页 |
| 2.4.4 苍耳叶片和腺毛总RNA质量分析 | 第40-42页 |
| 2.4.5 苍耳叶片和腺毛的转录组测序结果 | 第42-55页 |
| 2.4.5.1 测序产量概况 | 第42-43页 |
| 2.4.5.2 测序产量概况 | 第43-45页 |
| 2.4.5.3 基因注释和分类 | 第45-47页 |
| 2.4.5.4 GO分类 | 第47-48页 |
| 2.4.5.5 COG分类 | 第48-49页 |
| 2.4.5.6 KEGG分析 | 第49页 |
| 2.4.5.7 编码蛋白框预测 | 第49-51页 |
| 2.4.5.8 差异表达基因分析 | 第51-53页 |
| 2.4.5.9 测序深度分析 | 第53-55页 |
| 2.5 基于苍耳转录组数据库倍半萜内酯合成基因的筛选 | 第55-60页 |
| 2.5.1 MVA和MEP途径 | 第55页 |
| 2.5.2 倍半萜类化合物过渡阶段中间体的合成 | 第55页 |
| 2.5.3 倍半萜合酶基因挖掘 | 第55-57页 |
| 2.5.4 CYP450基因挖掘 | 第57页 |
| 2.5.5 乙酰转移酶基因挖掘 | 第57页 |
| 2.5.6 过氧化物水解酶/氧环化酶 | 第57-58页 |
| 2.5.7 醇/醛脱氢酶 | 第58页 |
| 2.5.8 转录因子 | 第58页 |
| 2.5.9 SSR分析 | 第58-59页 |
| 2.5.10 差异基因的表达模式分析 | 第59-60页 |
| 2.6 讨论 | 第60-62页 |
| 2.7 结论与展望 | 第62-65页 |
| 2.7.1 结论 | 第62-63页 |
| 2.7.2 展望 | 第63-65页 |
| 第三章 苍耳倍半萜合酶基因功能分析 | 第65-103页 |
| 3.1 前言 | 第65页 |
| 3.2 材料与方法 | 第65-69页 |
| 3.2.1 材料 | 第65-66页 |
| 3.2.2 菌株和质粒 | 第66页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第66-67页 |
| 3.2.4 本研究所用的引物 | 第67-68页 |
| 3.2.5 本研究所用的仪器 | 第68-69页 |
| 3.2.6 引物和测序 | 第69页 |
| 3.3 培养基和缓冲液配制 | 第69-71页 |
| 3.3.1 LB培养基 | 第69页 |
| 3.3.2 YPDA培养基 | 第69页 |
| 3.3.3 酵母缺陷型培养基 | 第69-70页 |
| 3.3.4 TAE缓冲液 | 第70页 |
| 3.3.5 SDS/PAGE相关缓冲液与凝胶 | 第70页 |
| 3.3.6 蛋白质提取纯化相关缓冲液配方 | 第70-71页 |
| 3.3.7 纯化蛋白反应缓冲液 | 第71页 |
| 3.4 实验方法 | 第71-79页 |
| 3.4.1 PCR反应 | 第71页 |
| 3.4.1.1 引物设计 | 第71页 |
| 3.4.1.2 PCR反应 | 第71页 |
| 3.4.1.3 PCR产物进行电泳 | 第71页 |
| 3.4.2 PCR产物或限制性内切酶酶切片段的回收 | 第71-72页 |
| 3.4.3 DNA酶切反应 | 第72页 |
| 3.4.4 DNA连接反应 | 第72-73页 |
| 3.4.5 大肠杆菌(DH5α和BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化 | 第73-74页 |
| 3.4.6 菌落PCR | 第74页 |
| 3.4.7 质粒提取(艾德莱质粒小量快速提取试剂盒) | 第74-75页 |
| 3.4.8 酵母感受细胞制备及转化 | 第75页 |
| 3.4.9 酵母菌液PCR鉴定 | 第75-76页 |
| 3.4.10 酵母诱导 | 第76页 |
| 3.4.11 产物提取 | 第76页 |
| 3.4.12 倍半萜合酶的系统发育分析 | 第76页 |
| 3.4.13 倍半萜合酶基因的原核表达 | 第76-78页 |
| 3.4.13.1 原核表达载体的构建和转化 | 第76-77页 |
| 3.4.13.2 目的蛋白的诱导表达 | 第77页 |
| 3.4.13.3 蛋白提取和纯化 | 第77-78页 |
| 3.4.13.4 体外酶促反应及产物分析 | 第78页 |
| 3.4.14 倍半萜烯的GC-MS检测 | 第78-79页 |
| 3.5 实验结果 | 第79-98页 |
| 3.5.1 叶片挥发油成分分析 | 第79-82页 |
| 3.5.2 苍耳倍半萜合酶基因的克隆 | 第82-86页 |
| 3.5.3 苍耳倍半萜合酶XsTPSs的体内功能验证 | 第86-92页 |
| 3.5.3.1 苍耳倍半萜合酶XsTPSs酵母表达载体构建 | 第86页 |
| 3.5.3.2 苍耳倍半萜合酶XsTPSs功能分析 | 第86-92页 |
| 3.5.4 苍耳倍半萜合酶XsTPSs的体外功能验证 | 第92-95页 |
| 3.5.4.1 苍耳倍半萜合酶XsTPSs原核表达载体构建 | 第92-93页 |
| 3.5.4.2 苍耳倍半萜合酶XsTPSs蛋白诱导表达与纯化 | 第93页 |
| 3.5.4.3 苍耳倍半萜合酶XsTPSs体外功能验证 | 第93-95页 |
| 3.5.5 苍耳倍半萜合酶XsTPSs基因表达模式和产物积累模式分析 | 第95-98页 |
| 3.6 讨论 | 第98-101页 |
| 3.7 结果与展望 | 第101-103页 |
| 3.7.1 实验结果 | 第101页 |
| 3.7.2 展望 | 第101-103页 |
| 第四章 苍耳腺体特异性表达CYP450基因功能分析 | 第103-125页 |
| 4.1 前言 | 第103-105页 |
| 4.2 材料和方法 | 第105-110页 |
| 4.2.1 菌株和载体 | 第105-106页 |
| 4.2.2 本章所用引物 | 第106-107页 |
| 4.2.3 苍耳倍半萜内酯生物合成途径下游候选CYP基因的克隆 | 第107-109页 |
| 4.2.4 CYP450诱导表达 | 第109页 |
| 4.2.5 诱导产物提取及检测 | 第109页 |
| 4.2.6 XsCYP3催化产物的纯化 | 第109-110页 |
| 4.3 实验结果 | 第110-122页 |
| 4.3.1 苍耳CYP450基因的克隆及酵母表达载体的构建 | 第110-113页 |
| 4.3.2 苍耳CYP450基因的功能分析 | 第113-121页 |
| 4.3.2.1 功能基因筛选及分析 | 第113-117页 |
| 4.3.2.2 体外功能验证 | 第117-118页 |
| 4.3.2.3 底物特异性分析 | 第118-121页 |
| 4.3.3 苍耳CYP基因的表达特性分析 | 第121-122页 |
| 4.4 讨论 | 第122-123页 |
| 4.5 结论 | 第123-124页 |
| 4.6 展望 | 第124-125页 |
| 参考文献 | 第125-133页 |
| 附录 | 第133-149页 |
| 致谢 | 第149-151页 |
| 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第151页 |
