| 中文摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-23页 |
| 1.1 血红素概述 | 第12-15页 |
| 1.1.1 血红素的功能 | 第12页 |
| 1.1.2 血红素的合成 | 第12-13页 |
| 1.1.3 .血红素的代谢与卟啉症 | 第13-15页 |
| 1.2 HMBS基因概述 | 第15-16页 |
| 1.3 斑马鱼的优点及研究现状 | 第16-17页 |
| 1.4 斑马鱼的肝脏发育调控 | 第17-19页 |
| 1.5 CRISPR-CaS9作用机制及在斑马鱼中的研究 | 第19-20页 |
| 1.6 立题依据和研究意义 | 第20-23页 |
| 第二章 材料与方法 | 第23-52页 |
| 2.1 实验材料 | 第23页 |
| 2.2 实验试剂 | 第23-24页 |
| 2.3 实验仪器 | 第24-25页 |
| 2.4 实验试剂配制 | 第25-27页 |
| 2.4.1 细菌培养基 | 第25-26页 |
| 2.4.2 抗生素 | 第26页 |
| 2.4.3 核酸电泳相关缓冲液 | 第26页 |
| 2.4.4 原位杂交相关试剂 | 第26-27页 |
| 2.4.5 冷冻切片相关溶液 | 第27页 |
| 2.4.6 油红O染色相关溶液 | 第27页 |
| 2.4.7 Bodipy染色相关溶液 | 第27页 |
| 2.4.8 其他溶液 | 第27页 |
| 2.5 引物设计与合成 | 第27-29页 |
| 2.6 实验设计及方法 | 第29-52页 |
| 2.6.1 斑马鱼交配及产卵 | 第29页 |
| 2.6.2 斑马鱼基因组DNA的提取 | 第29-30页 |
| 2.6.3 胚胎总RNA的提取 | 第30页 |
| 2.6.4 mRNA反转成cDNA | 第30-31页 |
| 2.6.5 PCR扩增目的片段 | 第31页 |
| 2.6.6 荧光定量PCR | 第31-32页 |
| 2.6.7 启动子的克隆 | 第32-36页 |
| 2.6.8 显微注射 | 第36页 |
| 2.6.9 原位杂交过程 | 第36-38页 |
| 2.6.10 O-dianisidine染色 | 第38页 |
| 2.6.11 石蜡切片 | 第38-39页 |
| 2.6.12 HE染色 | 第39页 |
| 2.6.13 透射电子电镜 | 第39-40页 |
| 2.6.14 油红O染色(幼鱼) | 第40页 |
| 2.6.15 油红O染色(切片) | 第40页 |
| 2.6.16 Bodipy染色(切片) | 第40-41页 |
| 2.6.17 细胞培养 | 第41-42页 |
| 2.6.18 荧光素酶表达水平的检测 | 第42页 |
| 2.6.19 定点突变(用于细胞转染) | 第42页 |
| 2.6.20 ChIP | 第42-43页 |
| 2.6.21 运用CRISPR-Cas9技术构建hmbsb斑马鱼突变体 | 第43-46页 |
| 2.6.21.1 CRISPR-Cas9靶位点的设计 | 第43页 |
| 2.6.21.2 制备Cas9mRNA | 第43页 |
| 2.6.21.3 gRNA 的合成 | 第43-45页 |
| 2.6.21.4 将gRNA纯化 | 第45页 |
| 2.6.21.5 胚胎显微注射 | 第45-46页 |
| 2.6.21.6 CRISPR-Cas9突变效率检测 | 第46页 |
| 2.6.21.7 得到可遗传hmbsb纯合突变体品系 | 第46页 |
| 2.6.22 成鱼行为 | 第46-47页 |
| 2.6.23 构建组织特异性敲除 | 第47-48页 |
| 2.6.24 Konckin法构建转基因鱼 | 第48-50页 |
| 2.6.25 高效液相色谱实验 | 第50页 |
| 2.6.26 高通量深度测序 | 第50页 |
| 2.6.27 数据统计分析 | 第50-52页 |
| 第三章 实验结果及分析 | 第52-79页 |
| 3.1 运用CRISPR-CaS9技术构建hmbsb基因缺陷的斑马鱼突变体 | 第52-54页 |
| 3.1.1 Cas9位点设计及gRNA合成 | 第52-53页 |
| 3.1.2 CRISPR-Cas9突变效率检测 | 第53页 |
| 3.1.3 hmbsb-/-突变体筛选 | 第53-54页 |
| 3.2 整体原位杂交实验检测hmbsa和hmbsb基因在斑马鱼体内的表达情况 | 第54-55页 |
| 3.3 斑马鱼hmbsa-/-和hmbsb-/-突变体可作为人类AIP疾病模型 | 第55-61页 |
| 3.3.1 hmbsa和hmbsb的缺失导致斑马鱼体内血红素水平降低 | 第55-57页 |
| 3.3.2 hmbsa-/-和hmbsb-/-突变体中ALA和PBG积累并且表现精神异常性 | 第57-58页 |
| 3.3.3 人类HMBSmRNA及血红素能够拯救突变体的表型 | 第58-61页 |
| 3.4 hmbsa-/-和hmbsb-/-突变体的肝脏具有脂滴积累的现象 | 第61-66页 |
| 3.5 hmbsa-/-和hmbsb-/-突变体的肝脏组织转录组测序 | 第66-72页 |
| 3.5.1 测序样品的准备 | 第66页 |
| 3.5.2 斑马鱼hmbsa和hmbsb基因转录组测序结果分析 | 第66-72页 |
| 3.6 血红素缺失导致fabp10a基因表达下调 | 第72-74页 |
| 3.7 fabp10a通过Bach1b/Nrf2a-Mafk信号通路受血红素的调节 | 第74-79页 |
| 第四章 讨论 | 第79-86页 |
| 4.1 运用CRISPR-Cas9技术成功构建hmbsb基因缺陷的斑马鱼突变体 | 第79-80页 |
| 4.2 斑马鱼hmbsa-/-和hmbsb-/-突变体中血红素合成障碍 | 第80页 |
| 4.3 斑马鱼hmbsa-/-和hmbsb-/-突变体可以作为人类AIP模型 | 第80-81页 |
| 4.4 hmbsa-/-和hmbsb-/-纯合突变体表现出肝脏脂滴积累现象 | 第81-82页 |
| 4.5 hmbsa-/-和hmbsb-/-突变体的转录组测序分析 | 第82-84页 |
| 4.6 血红素可以通过Bach1b/Nrf2a-Mafk途径调节fabp10a基因的表达 | 第84-86页 |
| 第五章 结论 | 第86-87页 |
| 第六章 展望 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-94页 |
| 附录 | 第94-95页 |
| 研究生期间已发表和待发表的论文 | 第95-96页 |
| 致谢 | 第96-98页 |
