| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略词 | 第13-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-28页 |
| 1.1 铝的毒害作用 | 第15页 |
| 1.2 耐铝微生物的分离和鉴定 | 第15-17页 |
| 1.3 微生物中的耐铝机制 | 第17-19页 |
| 1.3.1 有机酸及其代谢途径产物对铝的螯合作用 | 第17页 |
| 1.3.2. 抗氧化胁迫作用 | 第17-18页 |
| 1.3.3. 抗细胞程序性死亡 | 第18页 |
| 1.3.4 其它金属离子的作用 | 第18-19页 |
| 1.3.5 其他微生物中存在的耐铝机制 | 第19页 |
| 1.4 14-3-3蛋白 | 第19-24页 |
| 1.4.1 14-3-3蛋白在酵母中的生理功能 | 第20-21页 |
| 1.4.2 14-3-3蛋白的作用机制 | 第21-23页 |
| 1.4.3 14-3-3蛋白的全基因组研究 | 第23页 |
| 1.4.4 14-3-3蛋白活性的调控和与蛋白相结合的模式 | 第23-24页 |
| 1.5 质膜H~+-ATPase | 第24-27页 |
| 1.5.1 质膜H~+-ATPase的结构 | 第24-25页 |
| 1.5.2 质膜H~+-ATPase的生理功能 | 第25页 |
| 1.5.3 质膜H~+-ATPase和14-3-3的结合 | 第25-27页 |
| 1.6 本研究的目的意义及内容 | 第27-28页 |
| 第二章 耐铝酵母的筛选 | 第28-38页 |
| 2.1 材料和方法 | 第28-32页 |
| 2.1.1 仪器和试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.2 土壤样品 | 第29页 |
| 2.1.3 培养基 | 第29页 |
| 2.1.4 耐铝菌株的分离纯化 | 第29页 |
| 2.1.5 菌株形态观察 | 第29-30页 |
| 2.1.6 革兰氏染色方法 | 第30页 |
| 2.1.7 基因组的提取 | 第30页 |
| 2.1.8 ITS序列和26S D1/D2序列的PCR扩增及测序分析 | 第30-31页 |
| 2.1.9 ITS序列和26S rDNA D1/D2序列测定及系统进化分析 | 第31页 |
| 2.1.10 菌株耐铝水平的测定 | 第31页 |
| 2.1.11 菌株在铝胁迫下生长曲线的测定 | 第31页 |
| 2.1.12 剩余活性铝的测定 | 第31-32页 |
| 2.1.13 数据分析 | 第32页 |
| 2.2 实验结果与分析 | 第32-36页 |
| 2.2.1 分离出的菌株及其形态观察 | 第32页 |
| 2.2.2 ITS和26S rDNA D1/D2片段的PCR扩增 | 第32-33页 |
| 2.2.3 以ITS和26S rDNA D1/D2序列进行菌种鉴定和系统进化分析 | 第33-34页 |
| 2.2.4 不同浓度的铝对菌株生长的影响 | 第34-35页 |
| 2.2.5 不同浓度的铝下菌株的生长曲线 | 第35-36页 |
| 2.2.6 培养液中剩余活性铝 | 第36页 |
| 2.3 讨论 | 第36-38页 |
| 第三章 14-3-3蛋白原核表达纯化和多克隆抗体的制备 | 第38-51页 |
| 3.1 实验仪器和方法材料 | 第38-47页 |
| 3.1.1 仪器和试剂 | 第38-39页 |
| 3.1.2 培养基 | 第39页 |
| 3.1.3 菌株和质粒 | 第39页 |
| 3.1.4 抗生素和诱导剂的配制 | 第39页 |
| 3.1.5 酵母总RNA的提取和cDNA的合成 | 第39-40页 |
| 3.1.6 14-3-3基因的TA克隆 | 第40-41页 |
| 3.1.7 质粒抽提(碱裂解法) | 第41-42页 |
| 3.1.8 质粒酶切体系 | 第42页 |
| 3.1.9 琼脂糖凝胶电泳 | 第42页 |
| 3.1.10 目的DNA片段回收 | 第42-43页 |
| 3.1.11 目的片段的连接 | 第43页 |
| 3.1.12 质粒DNA的转化(热刺激转化方法) | 第43-44页 |
| 3.1.13 蛋白质浓度的测定 | 第44页 |
| 3.1.14 14-3-3 基因的原核表达载体的构建和蛋白诱导表达 | 第44-46页 |
| 3.1.15 Ni琼脂糖凝胶分离纯化目的蛋白 | 第46页 |
| 3.1.16 制备14-3-3蛋白抗体 | 第46-47页 |
| 3.2 结果与分析 | 第47-50页 |
| 3.2.1 14-3-3 基因原核表达载体的构建 | 第47-48页 |
| 3.2.2 14-3-3 蛋白的表达纯化和抗体的检测 | 第48-50页 |
| 3.3 讨论 | 第50-51页 |
| 第四章 铝胁迫下14-3-3蛋白与质膜H~+-ATPase的互做及生理活性的变化 | 第51-56页 |
| 4.1 材料和方法 | 第51-53页 |
| 4.1.1 菌种和培养基 | 第51页 |
| 4.1.2 酵母蛋白质提取 | 第51-52页 |
| 4.1.3 Western blotting分析 | 第52页 |
| 4.1.4 免疫共沉淀 | 第52页 |
| 4.1.5 质膜H~+-ATPase活性、氢泵活性测定 | 第52-53页 |
| 4.1.6 数据分析 | 第53页 |
| 4.2 实验结果 | 第53-55页 |
| 4.2.1 14-3-3 蛋白和质膜H~+-ATPase的相互作用 | 第53-54页 |
| 4.2.2 在不同铝处理下质膜H~+-ATPase和氢泵活性的变化 | 第54-55页 |
| 4.3 讨论 | 第55-56页 |
| 第五章 14-3-3转基因酵母的构建及其耐铝性特性的研究 | 第56-63页 |
| 5.1 材料和方法 | 第56-58页 |
| 5.1.1 菌种和培养基 | 第56页 |
| 5.1.2 酿酒酵母感受态细胞的制备 | 第56-57页 |
| 5.1.3 转基因酵母菌液PCR | 第57页 |
| 5.1.4 转基因酵母耐铝能力检测 | 第57页 |
| 5.1.5 培养基中剩余活性铝含量测定 | 第57-58页 |
| 5.1.6 转基因酵母生长曲线的测定 | 第58页 |
| 5.1.7 数据分析 | 第58页 |
| 5.2 结果分析 | 第58-62页 |
| 5.2.1 转基因酵母真核表达载体的构建 | 第58-59页 |
| 5.2.2 转基因酵母真核表达载体验证 | 第59-60页 |
| 5.2.3 测定转基因酵母的耐铝能力 | 第60页 |
| 5.2.4 转基因酵母在含铝液体培养基中的生长 | 第60-61页 |
| 5.2.5 培养基中剩余活性铝含量的变化 | 第61-62页 |
| 5.3 讨论 | 第62-63页 |
| 第六章 展望和总结 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-75页 |
| 附录A 攻读硕士期间发表的文章 | 第75页 |
