| 摘要 | 第11-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 前言 | 第17-25页 |
| 第一章 抗登革病毒人源单克隆抗体的筛选 | 第25-50页 |
| 1.1 实验材料 | 第25-29页 |
| 1.1.1 登革病毒感染患者外周血 | 第25页 |
| 1.1.2 菌株、细胞株、病毒株以及质粒 | 第25页 |
| 1.1.3 细胞培养基及转染试剂 | 第25-26页 |
| 1.1.4 实验耗材 | 第26页 |
| 1.1.5 分子生物学试剂 | 第26-27页 |
| 1.1.6 引物合成及测序 | 第27页 |
| 1.1.7 仪器设备 | 第27-28页 |
| 1.1.8 主要缓冲液及培养基 | 第28-29页 |
| 1.2 实验方法 | 第29-40页 |
| 1.2.1 外周血单核淋巴细胞分离 | 第29-30页 |
| 1.2.2 流式细胞术分选单个B细胞 | 第30-31页 |
| 1.2.3 反转录PCR从单B细胞扩增抗体轻重链可变区基因 | 第31-32页 |
| 1.2.4 巢式PCR从单B细胞扩增抗体轻重链可变区基因 | 第32-34页 |
| 1.2.5 抗体真核表达质粒构建 | 第34-36页 |
| 1.2.6 质粒抽提 | 第36页 |
| 1.2.7 FreeStyle~(TM) HEK293-F细胞培养与传代 | 第36页 |
| 1.2.8 抗体的瞬时表达 | 第36-37页 |
| 1.2.9 基于AKTA纯化系统的抗体纯化与缓冲液置换 | 第37-38页 |
| 1.2.10 SDS-PAGE蛋白电泳及染色 | 第38页 |
| 1.2.11 登革病毒的培养 | 第38-39页 |
| 1.2.12 登革病毒滴度测定 | 第39页 |
| 1.2.13 ELISA筛选特异结合登革病毒的抗体 | 第39-40页 |
| 1.2.14 针对DENV-1的中和抗体筛选 | 第40页 |
| 1.2.15 统计学分析 | 第40页 |
| 1.3 实验结果 | 第40-48页 |
| 1.3.1 外周血淋巴细胞分离与单个B细胞分选 | 第40-41页 |
| 1.3.2 反转录PCR和巢式PCR两步扩增抗体轻重链可变区基因 | 第41-43页 |
| 1.3.3 抗体真核表达质粒构建 | 第43页 |
| 1.3.4 抗体表达与纯化 | 第43-45页 |
| 1.3.5 登革病毒的培养与滴度测定 | 第45-46页 |
| 1.3.6 登革病毒特异性抗体筛选 | 第46-47页 |
| 1.3.7 登革病毒特异性抗体针对DENV-1的中和活性检测 | 第47-48页 |
| 1.4 讨论 | 第48-50页 |
| 第二章 抗体的生物学活性检测 | 第50-70页 |
| 2.1 实验材料 | 第50-53页 |
| 2.1.1 细胞株和病毒株 | 第50页 |
| 2.1.2 细胞培养基 | 第50页 |
| 2.1.3 实验耗材 | 第50-51页 |
| 2.1.4 分子生物学试剂 | 第51页 |
| 2.1.5 动物饲养相关材料 | 第51页 |
| 2.1.6 仪器设备 | 第51-52页 |
| 2.1.7 主要缓冲液及培养基 | 第52-53页 |
| 2.1.8 实验动物 | 第53页 |
| 2.2 实验方法 | 第53-58页 |
| 2.2.1 病毒的培养 | 第53页 |
| 2.2.2 病毒滴度测定 | 第53页 |
| 2.2.3 蛋白免疫印迹 | 第53-54页 |
| 2.2.4 抗体亲和力分析：酶联免疫吸附试验 | 第54页 |
| 2.2.5 抗体亲和力分析：SPR蛋白质相互作用系统 | 第54-55页 |
| 2.2.6 空斑减少中和实验 | 第55页 |
| 2.2.7 病毒感染乳鼠的半数致死剂量测定 | 第55页 |
| 2.2.8 乳鼠保护试验 | 第55-56页 |
| 2.2.9 病毒感染抑制实验 | 第56-57页 |
| 2.2.10 抗体依赖的感染增强检测 | 第57页 |
| 2.2.11 统计学分析 | 第57-58页 |
| 2.3 实验结果 | 第58-68页 |
| 2.3.1 Westernblot检测抗体血清型特异性并确定其靶蛋白 | 第58-59页 |
| 2.3.2 ELISA分析抗体亲和力 | 第59-61页 |
| 2.3.3 SPR分析6B1与DENV-1重组E蛋白的亲和力 | 第61-62页 |
| 2.3.4 PRNT分析抗体的体外中和活性 | 第62-63页 |
| 2.3.5 抗体的体内抗病毒活性 | 第63-67页 |
| 2.3.6 抗体发挥中和作用的阶段 | 第67-68页 |
| 2.3.7 抗体依赖感染增强活性检测 | 第68页 |
| 2.4 讨论 | 第68-70页 |
| 第三章 无感染增强作用中和抗体的制备与鉴定 | 第70-80页 |
| 3.1 实验材料 | 第70-73页 |
| 3.1.1 菌株、细胞株、病毒株以及质粒 | 第70页 |
| 3.1.2 细胞培养基及转染试剂 | 第70-71页 |
| 3.1.3 实验耗材 | 第71页 |
| 3.1.4 分子生物学试剂 | 第71页 |
| 3.1.5 引物合成及测序 | 第71页 |
| 3.1.6 仪器设备 | 第71-72页 |
| 3.1.7 主要缓冲液及培养基 | 第72-73页 |
| 3.2 实验方法 | 第73-76页 |
| 3.2.1 抗体重链真核表达载体的突变改构 | 第73-75页 |
| 3.2.2 利用改构载体构建抗体重链真核表达质粒 | 第75页 |
| 3.2.3 无感染增强作用抗体的瞬时表达 | 第75页 |
| 3.2.4 病毒的培养 | 第75页 |
| 3.2.5 病毒滴度测定 | 第75页 |
| 3.2.6 抗体依赖的感染增强检测 | 第75页 |
| 3.2.7 统计学分析 | 第75-76页 |
| 3.3 实验结果 | 第76-79页 |
| 3.3.1 抗体重链真核表达载体的改构 | 第76页 |
| 3.3.2 Fc突变抗体重链真核表达质粒构建 | 第76-77页 |
| 3.3.3 表达与纯化Fc突变的1G5和9C7抗体 | 第77-78页 |
| 3.3.4 改构抗体的ADE作用分析 | 第78-79页 |
| 3.4 讨论 | 第79-80页 |
| 第四章 免疫缺陷小鼠模型构建 | 第80-92页 |
| 4.1 实验材料 | 第80-81页 |
| 4.1.1 实验耗材 | 第80页 |
| 4.1.2 分子生物学试剂 | 第80-81页 |
| 4.1.3 动物饲养相关材料 | 第81页 |
| 4.1.4 仪器设备 | 第81页 |
| 4.1.5 主要缓冲液及培养基 | 第81页 |
| 4.1.6 实验动物 | 第81页 |
| 4.2 实验方法 | 第81-86页 |
| 4.2.1 Ifnar1和Ifngr1基因敲除Founder小鼠的制备 | 第81-84页 |
| 4.2.2 Founder小鼠基因型鉴定 | 第84-86页 |
| 4.2.3 阳性Founder小鼠传代至F1代及其基因型鉴定 | 第86页 |
| 4.2.4 F1代小鼠自交获得F2代及其基因型鉴定 | 第86页 |
| 4.3 实验结果 | 第86-90页 |
| 4.3.1 体外转录获得gRNA与Cas9-mRNA | 第86-87页 |
| 4.3.2 Founder小鼠的基因型鉴定 | 第87-88页 |
| 4.3.3 F1代小鼠的基因型鉴定 | 第88页 |
| 4.3.4 F2代小鼠的基因型鉴定 | 第88-90页 |
| 4.4 讨论 | 第90-92页 |
| 第五章 结论与展望 | 第92-95页 |
| 参考文献 | 第95-102页 |
| 在学期间取得的学术成果 | 第102-103页 |
| 个人简历 | 第103-104页 |
| 致谢 | 第104页 |
