| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 1 引文和文献综述 | 第13-20页 |
| 1.1 心脏发育过程 | 第13-14页 |
| 1.2 模式动物—小鼠 | 第14页 |
| 1.3 TGF-β/Smads信号途径及其与心肌肥大的关系 | 第14-18页 |
| 1.3.1 TGF-β 超家族 | 第14-15页 |
| 1.3.2 Smads蛋白家族 | 第15-17页 |
| 1.3.3 TGF-β 信号转导的Smads通路 | 第17页 |
| 1.3.4 TGF-β/Smads信号通路与心肌肥大的关系 | 第17-18页 |
| 1.4 本文研究意义 | 第18-20页 |
| 2 材料与方法 | 第20-45页 |
| 2.1 材料 | 第20-26页 |
| 2.1.1 所用生物信息学工具 | 第20-21页 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 | 第21-22页 |
| 2.1.3 质粒 | 第22-26页 |
| 2.1.3.1 腺病毒包装质粒 | 第22-23页 |
| 2.1.3.2 表达型质粒 | 第23-25页 |
| 2.1.3.3 克隆型质粒 | 第25-26页 |
| 2.2 腺病毒构建方法 | 第26-37页 |
| 2.2.1 主要试剂配制 | 第26页 |
| 2.2.2 重组质粒pMD18-T-HFHG5的构建 | 第26-30页 |
| 2.2.2.1 总RNA的抽提 | 第26-27页 |
| 2.2.2.2 反转录RT-PCR | 第27页 |
| 2.2.2.3 PCR产物的纯化回收 | 第27-28页 |
| 2.2.2.4 连接T载体 | 第28页 |
| 2.2.2.5 感受态细胞DH5a的制备 | 第28-29页 |
| 2.2.2.6 转化及扩培（热休克法） | 第29页 |
| 2.2.2.7 质粒的制备 | 第29-30页 |
| 2.2.2.8 质粒酶切 | 第30页 |
| 2.2.3 穿梭质粒pAdTrack-HFHG5的构建 | 第30-32页 |
| 2.2.3.1 穿梭质粒pAdTrack-CMV的线性化 | 第31页 |
| 2.2.3.2 目的片段与线性化pAdTrack-CMV载体连接、转化及扩培 | 第31页 |
| 2.2.3.3 重组质粒的酶切鉴定 | 第31页 |
| 2.2.3.4 重组质粒的测序 | 第31-32页 |
| 2.2.4 重组腺病毒载体Ad-HFHG5的构建 | 第32-35页 |
| 2.2.4.1 穿梭质粒pAdTrack-HFHG5的单酶切线性化 | 第32页 |
| 2.2.4.2 电转化感受态细菌的制备 | 第32-33页 |
| 2.2.4.3 线性化的pAdTrack-HFHG5穿梭载体转化 | 第33页 |
| 2.2.4.4 重组腺病毒载体pAd-HFHG5筛选 | 第33-34页 |
| 2.2.4.5 提取无内毒素质粒 | 第34页 |
| 2.2.4.6 重组腺病毒载体pAd-HFHG5单酶切及鉴定 | 第34-35页 |
| 2.2.5 腺病毒的制备 | 第35-37页 |
| 2.2.5.1 准备 293A细胞 | 第35页 |
| 2.2.5.2 转染实验 | 第35页 |
| 2.2.5.3 收集病毒 | 第35-36页 |
| 2.2.5.4 扩增病毒 | 第36-37页 |
| 2.3 新生大鼠原代心肌细胞的分离与培养 | 第37页 |
| 2.4 重组质粒pSuper-HFHG5-shRNA构建方法 | 第37-40页 |
| 2.4.1 设计HFHG5 shRNA模板寡核苷酸 | 第37-39页 |
| 2.4.2 正反义链的退火反应 | 第39页 |
| 2.4.3 pSuper质粒的双酶切线性化 | 第39-40页 |
| 2.4.4 退火目的片段与线性化pSuper的连接、转化及扩培 | 第40页 |
| 2.4.5 重组质粒的酶切鉴定 | 第40页 |
| 2.4.6 shRNA干扰效率的验证 | 第40页 |
| 2.5 免疫荧光实验 | 第40-42页 |
| 2.6 提取核质蛋白及Western blot实验 | 第42-45页 |
| 2.6.1 细胞核/质蛋白的提取 | 第42页 |
| 2.6.2 Western blot实验 | 第42-45页 |
| 3 实验结果及其分析 | 第45-55页 |
| 3.1 腺病毒Ad-HFHG5的制备 | 第45-47页 |
| 3.1.1 穿梭质粒pAdTrack-HFHG5的构建及鉴定 | 第45页 |
| 3.1.2 穿梭质粒pAdTrack-HFHG5的测序鉴定 | 第45-46页 |
| 3.1.3 重组腺病毒载体pAd-HFHG5的酶切鉴定 | 第46-47页 |
| 3.1.4 线性化重组腺病毒载体pAd-HFHG5转染HEK293A细胞 | 第47页 |
| 3.2 重组质粒pSuper-HFHG5-shRNA构建 | 第47-50页 |
| 3.2.1 退火反应合成目的片段 | 第47-48页 |
| 3.2.2 重组质粒pSuper-HFHG5-shRNA的酶切鉴定 | 第48-49页 |
| 3.2.3 验证pSuper-HFHG5-shRNA对HFHG5表达的干扰效率 | 第49-50页 |
| 3.3 重组质粒pCMV-Myc-h-HFHG5的鉴定 | 第50页 |
| 3.4 PE及FBS刺激原代心肌细胞，HFHG5的表达会发生上调 | 第50-52页 |
| 3.5 HFHG5与Smad4在亚细胞中有共定位 | 第52页 |
| 3.6 HFHG5通过促进Smad4入核，从而促进了心肌肥大 | 第52-55页 |
| 3.6.1 过表达HFHG5促进Smad4的入核 | 第52-53页 |
| 3.6.2 促进心肌肥大的机制的初步研究 | 第53-55页 |
| 4 讨论 | 第55-58页 |
| 5 其他工作 | 第58-62页 |
| 5.1 构建多种类型载体 | 第58-59页 |
| 5.2 体外合成HFHG5的特异性探针和非特异性探针 | 第59页 |
| 5.3 注射ISO和生理盐水，诱导Lrrc10、pygo1小鼠心脏肥厚 | 第59-60页 |
| 5.4 荧光报告系统实验 | 第60页 |
| 5.5 多种基因型小鼠的繁殖及鉴定 | 第60-62页 |
| 结语 | 第62-64页 |
| 参考文献 | 第64-70页 |
| 附录 | 第70-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
