| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第12-13页 |
| 前言 | 第13-20页 |
| 1 鸭呼肠孤病毒的研究进展 | 第13-14页 |
| 2 双链RNA激活蛋白激酶 | 第14-18页 |
| 2.1 PKR概述 | 第14-16页 |
| 2.1.1 PKR的抑制蛋白翻译的作用 | 第15页 |
| 2.1.2 PKR诱导细胞凋亡 | 第15页 |
| 2.1.3 PKR诱导炎症反应 | 第15-16页 |
| 2.2 PKR介导的炎症信号通路 | 第16-18页 |
| 2.2.1 PKR介导的MAPKs炎症反应 | 第16页 |
| 2.2.2 PKR介导的NF-κB信号通路 | 第16-17页 |
| 2.2.3 PKR介导的IPS-1 信号通路 | 第17-18页 |
| 3 鸭肿瘤坏死因子 α 概述 | 第18-20页 |
| 3.1 禽类炎性相关因子的概述 | 第18页 |
| 3.2 鸭肿瘤坏死因子 | 第18-19页 |
| 3.3 TNF-α 在脾炎症中的作用 | 第19-20页 |
| 研究目的及意义 | 第20-21页 |
| 材料与方法 | 第21-37页 |
| 1 材料 | 第21-24页 |
| 1.1 试验动物、毒株、抗体及表达相关材料 | 第21页 |
| 1.2 主要仪器设备 | 第21-22页 |
| 1.3 主要试剂 | 第22页 |
| 1.4 主要试剂配制 | 第22-24页 |
| 1.4.1 RNA提取相关试剂 | 第22页 |
| 1.4.2 细菌培养、蛋白表达纯化相关试剂 | 第22-24页 |
| 1.4.3 ELISA相关试剂 | 第24页 |
| 1.4.4 透析袋的处理 | 第24页 |
| 2 试验方法 | 第24-37页 |
| 2.1 DuTNF-α 多克隆抗体的制备 | 第24-29页 |
| 2.1.1 DuTNF-α 基因的PCR引物设计 | 第24页 |
| 2.1.2 RT-PCR对目的基因的扩增 | 第24-25页 |
| 2.1.3 PCR产物的回收 | 第25-26页 |
| 2.1.4 重组原核表达质粒的构建 | 第26-27页 |
| 2.1.5 重组质粒的提取与鉴定 | 第27-28页 |
| 2.1.6 重组蛋白的表达与鉴定 | 第28-29页 |
| 2.1.7 重组蛋白的纯化与复性 | 第29页 |
| 2.1.8 免疫方案 | 第29页 |
| 2.2 多克隆抗体DuTNF-α 的鉴定 | 第29-30页 |
| 2.2.1 间接ELISA检测血清免疫原性 | 第29-30页 |
| 2.2.2 DuTNF-α 在肝、脾免疫组织化学鉴定 | 第30页 |
| 2.3 试验动物分组及处理 | 第30页 |
| 2.4 试验样品的采集与保存 | 第30页 |
| 2.5 感染JZ061214株DRV雏鸭的组织学病理变化动态观察 | 第30-31页 |
| 2.6 鸭呼肠孤病毒及巨噬细胞在脾组织中的定位 | 第31-32页 |
| 2.7 实时荧光定量RT-PCR检测雏鸭脾PKR介导的炎症信号通路相关因子及炎性因子mRNA的表达量 | 第32-35页 |
| 2.7.1 组织总RNA的提取 | 第32页 |
| 2.7.2 引物的设计 | 第32-33页 |
| 2.7.3 RT- PCR扩增检测脾PKR、MKK6、AP-1 和IPS-1 基因 | 第33-34页 |
| 2.7.4 实时荧光定量PCR扩增目的基因 | 第34-35页 |
| 2.8 脾脏中TNF-α 的免疫组化定量分析 | 第35-36页 |
| 2.9 数据分析 | 第36-37页 |
| 试验结果 | 第37-54页 |
| 1 DuTNF-α 多克隆抗体的制备 | 第37-41页 |
| 1.1 DuTNF-α 的克隆 | 第37页 |
| 1.2 重组原核表达质粒的构建 | 第37-38页 |
| 1.3 DuTNF-α 基因序列分析 | 第38-39页 |
| 1.4 重组表达质粒pET-28a-TNF-α 的酶切鉴定 | 第39页 |
| 1.5 重组菌的诱导表达产物鉴定与纯化 | 第39-40页 |
| 1.6 重组蛋白的Western-bolt鉴定 | 第40-41页 |
| 2 多克隆抗体的制备与反应原性检测 | 第41-42页 |
| 2.1 免疫兔血清抗体效价的测定 | 第41页 |
| 2.2 免疫组化检测DuTNF-α 的反应原性 | 第41-42页 |
| 3 雏鸭感染JZ061214株DRV的临床表现与眼观病变 | 第42-43页 |
| 4 JZ061214株DRV感染雏鸭的组织学病理变化结果 | 第43-45页 |
| 5 免疫组织化学技术检测脾病毒的组织分布 | 第45-46页 |
| 6 免疫组织化学技术检测脾炎症反应 | 第46-47页 |
| 7 实时荧光定量RT-PCR检测雏鸭脾PKR介导的炎症信号通路相关因子及炎性因子mRNA的表达量 | 第47-52页 |
| 7.1 实时荧光定量检测目的基因结果 | 第47页 |
| 7.2 RT-qPCR检测脾PKR、MKK6、AP-1、IPS-1、NF-κB、TNF-α、IL-6 的mRNA表达量结果 | 第47-52页 |
| 8 TNF-α 在脾中的表达检测 | 第52-54页 |
| 讨论 | 第54-58页 |
| 1 DuTNF-α 克隆表达与多克隆抗体的制备 | 第54页 |
| 2 JZ株061214株DRV感染雏鸭的临床症状和脾脏病理变化的动态观察 | 第54-55页 |
| 3 炎症反应在DRV引起脾损伤中的作用 | 第55-58页 |
| 3.1 DRV感染雏鸭后脾炎症反应检测 | 第55页 |
| 3.2 PKR介导的炎症信号通路在脾损伤中的作用 | 第55-58页 |
| 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
