| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 目录 | 第7-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-30页 |
| ·天然产物生物合成中酶分子改造的意义 | 第10-20页 |
| ·酶催化机理的阐明 | 第10-12页 |
| ·酶分子改造在生物催化中的应用 | 第12-18页 |
| ·酶分子改造在代谢工程中的应用 | 第18-20页 |
| ·酶分子改造中的基本技术 | 第20-23页 |
| ·酶突变库的构建 | 第21-23页 |
| ·酶突变库的筛选 | 第23页 |
| ·米多霉素生物合成与胞苷单磷酸羟甲基化酶 | 第23-28页 |
| ·米多霉素的生物合成 | 第23-25页 |
| ·胞苷单磷酸羟甲基化酶MilA 及其核糖底物特异性 | 第25-28页 |
| ·本研究内容和目的 | 第28-30页 |
| 第二章 材料与方法 | 第30-41页 |
| ·实验材料 | 第30-33页 |
| ·菌株 | 第30-31页 |
| ·质粒 | 第31页 |
| ·培养基和化学试剂 | 第31-32页 |
| ·本实验所用的PCR 引物 | 第32-33页 |
| ·实验方法 | 第33-41页 |
| ·菌种培养及菌种保藏 | 第33页 |
| ·大肠杆菌质粒DNA 的小量提取 | 第33页 |
| ·DNA 酶切、酶连及末端去磷酸化 | 第33-34页 |
| ·DNA 的琼脂糖凝胶电泳 | 第34页 |
| ·DNA 片段的回收 | 第34页 |
| ·DNA 的钙转化法 | 第34-35页 |
| ·DNA 的测序 | 第35页 |
| ·SDS 聚丙烯酰胺凝胶的配制 | 第35-36页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第36页 |
| ·考马斯亮蓝染色及脱色 | 第36页 |
| ·突变菌株的构建 | 第36-38页 |
| ·融合蛋白的表达 | 第38页 |
| ·融合蛋白的FPLC 纯化 | 第38页 |
| ·融合蛋白的重力柱纯化 | 第38-39页 |
| ·MilA 及其突变株的细胞裂解液的催化反应 | 第39页 |
| ·MilA 及其突变蛋白的体外催化反应 | 第39-40页 |
| ·氨基酸序列分析 | 第40页 |
| ·蛋白质高级结构分析 | 第40-41页 |
| 第三章 野生型 MilA 的体外反应和机理验证 | 第41-53页 |
| ·野生型MilA 与dCMP 的体外反应 | 第41-42页 |
| ·野生型MilA 对CMP 的底物偏好性 | 第42-44页 |
| ·野生型MilA 的酶动力学研究 | 第44-49页 |
| ·底物CMP 和dCMP 标准曲线的绘制 | 第44-46页 |
| ·反应动力学体系的优化 | 第46-48页 |
| ·野生型MilA 酶动力学参数的表征 | 第48-49页 |
| ·H_2~(18)O 喂养MilA 的体外反应 | 第49-52页 |
| ·本章小结 | 第52-53页 |
| 第四章 MilA 及其所在超家族同源蛋白的生物信息学分析 | 第53-63页 |
| ·MilA 同源蛋白的氨基酸序列比对 | 第54-57页 |
| ·MilA 同源蛋白的二级结构比对 | 第57-60页 |
| ·MilA 同源蛋白的三维结构分析 | 第60-62页 |
| ·本章小结 | 第62-63页 |
| 第五章 MilA 突变蛋白的底物特异性研究 | 第63-72页 |
| ·MilA 突变株的构建 | 第63-65页 |
| ·MilA 及其突变株细胞裂解液的催化反应 | 第65-67页 |
| ·MilA 及其突变蛋白的纯化 | 第67-70页 |
| ·MilA 及其突变蛋白的体外反应 | 第70-71页 |
| ·本章小结 | 第71-72页 |
| 第六章 全文总结 | 第72-74页 |
| ·主要结论 | 第72-73页 |
| ·研究展望 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 | 第82-85页 |
| 附件 | 第85页 |