| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略词和术语表 | 第11-14页 |
| 第一章 综述 | 第14-35页 |
| 1.1 前言 | 第14页 |
| 1.2 链霉菌中的转录调控因子 | 第14-23页 |
| 1.2.1 转录调控因子简介 | 第14-16页 |
| 1.2.2 基础代谢相关的转录调控因子 | 第16-20页 |
| 1.2.3 次级代谢相关的转录调控因子 | 第20-22页 |
| 1.2.4 链霉菌特有的转录调控因子 | 第22-23页 |
| 1.3 他克莫司及其生物合成 | 第23-28页 |
| 1.3.1 他克莫司概述 | 第23-24页 |
| 1.3.2 他克莫司在临床上的应用 | 第24-25页 |
| 1.3.3 他克莫司的生物合成 | 第25-28页 |
| 1.4 他克莫司的高产改造策略 | 第28-33页 |
| 1.4.1 中心代谢的改造 | 第28-31页 |
| 1.4.2 特殊前体供应上的加强 | 第31-32页 |
| 1.4.3 副产物途径的消除 | 第32-33页 |
| 1.4.4 调控途径的重组 | 第33页 |
| 1.5 本课题研究内容 | 第33-35页 |
| 第二章 FkbN在他克莫司生物合成中的调控机制研究 | 第35-64页 |
| 2.1 引言 | 第35页 |
| 2.2 实验材料 | 第35-42页 |
| 2.2.1 菌株 | 第35-36页 |
| 2.2.2 质粒 | 第36-37页 |
| 2.2.3 引物 | 第37-39页 |
| 2.2.4 培养基与培养条件 | 第39-40页 |
| 2.2.5 主要仪器与设备 | 第40-41页 |
| 2.2.6 常用试剂 | 第41-42页 |
| 2.3 实验方法 | 第42-53页 |
| 2.3.1 大肠杆菌质粒抽提 | 第42页 |
| 2.3.2 链霉菌基因组DNA的提取 | 第42-43页 |
| 2.3.3 PCR、双酶切与连接反应 | 第43-45页 |
| 2.3.4 核酸片段割胶回收 | 第45页 |
| 2.3.5 平末端DNA片段加dA尾 | 第45页 |
| 2.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第45-46页 |
| 2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第46页 |
| 2.3.8 大肠杆菌重组蛋白的表达 | 第46页 |
| 2.3.9 大肠杆菌重组蛋白的纯化 | 第46-47页 |
| 2.3.10 筑波链霉菌的培养 | 第47页 |
| 2.3.11 筑波链霉菌与大肠杆菌的接合转导 | 第47-48页 |
| 2.3.12 筑波链霉菌的摇瓶发酵 | 第48页 |
| 2.3.13 他克莫司的HPLC检测 | 第48页 |
| 2.3.14 载体构建 | 第48-49页 |
| 2.3.15 fkbN过表达重组菌株的构建 | 第49页 |
| 2.3.16 总RNA的提取 | 第49-50页 |
| 2.3.17 实时荧光定量PCR | 第50-51页 |
| 2.3.18 生物素标记的探针制备 | 第51页 |
| 2.3.19 凝胶阻滞电泳实验(EMSA) | 第51-52页 |
| 2.3.20 DNase I footprinting | 第52-53页 |
| 2.4 实验结果 | 第53-62页 |
| 2.4.1 FkbN的结构与功能分析 | 第53-54页 |
| 2.4.2 FkbN正调控他克莫司的生物合成 | 第54-56页 |
| 2.4.3 他克莫司生物合成基因簇转录单元分析 | 第56-57页 |
| 2.4.4 FkbN对他克莫司合成基因簇转录水平的影响 | 第57-58页 |
| 2.4.5 FkbN结合在簇内特定基因的启动子区 | 第58-62页 |
| 2.5 本章小结与讨论 | 第62-64页 |
| 第三章 Tcs7在他克莫司生物合成中的调控机制研究 | 第64-78页 |
| 3.1 引言 | 第64页 |
| 3.2 实验材料 | 第64-66页 |
| 3.2.1 菌株 | 第64-65页 |
| 3.2.2 质粒 | 第65页 |
| 3.2.3 引物 | 第65-66页 |
| 3.2.4 培养基与培养条件 | 第66页 |
| 3.2.5 主要仪器与设备 | 第66页 |
| 3.2.6 常用试剂 | 第66页 |
| 3.3 实验方法 | 第66-67页 |
| 3.3.1 tcs7相关载体构建 | 第66-67页 |
| 3.3.2 tcs7过表达菌株L22和tcs7,fkbN组合过表达菌株构建 | 第67页 |
| 3.4 实验结果 | 第67-75页 |
| 3.4.1 Tcs7的结构及功能分析 | 第67-68页 |
| 3.4.2 Tcs7正调控他克莫司的生物合成 | 第68-70页 |
| 3.4.3 Tcs7对他克莫司合成基因簇的转录水平影响 | 第70-71页 |
| 3.4.4 Tcs7结合在tcs6-tcs7间隔区 | 第71-73页 |
| 3.4.5 重组他克莫司生物合成的调控途径构建高产菌株 | 第73-74页 |
| 3.4.6 FkbN与Tcs7的调控关系 | 第74-75页 |
| 3.5 本章小结与讨论 | 第75-78页 |
| 第四章 结论与展望 | 第78-79页 |
| 4.1 本文结论 | 第78页 |
| 4.2 展望 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-88页 |
| 攻读硕士学位期间的主要研究成果 | 第88-89页 |
| 致谢 | 第89页 |
