| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略词中英文对照 | 第8-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-21页 |
| 1 肿瘤免疫治疗的研究现状 | 第13页 |
| 2 CAR-T疗法的概述 | 第13-17页 |
| 2.1 CAR-T简介 | 第13-14页 |
| 2.2 CAR-T疗法的优势 | 第14页 |
| 2.3 CAR-T的结构特征 | 第14-16页 |
| 2.4 CAR基因靶抗原的选择 | 第16-17页 |
| 3 PD-L1分子的相关研究 | 第17-19页 |
| 3.1 PD-L1分子与其受体PD-1 的结构与表达 | 第17-18页 |
| 3.1.1 PD-L1分子的结构和表达 | 第17页 |
| 3.1.2 PD-1 分子的结构与表达 | 第17-18页 |
| 3.2 PD-L1的生物学作用 | 第18页 |
| 3.2.1 PD-L1分子对肿瘤细胞的影响 | 第18页 |
| 3.2.2 PD-1/PD-L1途径对T细胞的影响 | 第18页 |
| 3.3 PD-1/PD-L1信号通路与肿瘤免疫 | 第18-19页 |
| 4 CAR-T疗法在国内外的研究进展 | 第19-21页 |
| 第二章 实验设计方案 | 第21-24页 |
| 1 选题的目的、意义 | 第21页 |
| 2 实验内容 | 第21-23页 |
| 3 实验流程图 | 第23-24页 |
| 第三章 PD-L1（73-739）重组质粒的构建以及PD-L1蛋白的原核表达和纯化 | 第24-36页 |
| 1 材料与试剂以及主要仪器 | 第24-27页 |
| 1.1 菌种 | 第24页 |
| 1.2 试剂 | 第24页 |
| 1.3 试剂的配制 | 第24-27页 |
| 1.4 主要仪器 | 第27页 |
| 2 方法 | 第27-32页 |
| 2.1 pETduet-SUMO-His-PD-L1(73-739)重组质粒的构建 | 第27-29页 |
| 2.1.1 双酶切pcDNA3.1-PD-L1(73-739)和pETduet-SUMO-His载体获得酶切片段 | 第27页 |
| 2.1.2 酶切片段的连接 | 第27-28页 |
| 2.1.3 CaCl2法制备E.coli TG1感受态细胞 | 第28页 |
| 2.1.4 连接产物的转化 | 第28-29页 |
| 2.1.5 重组质粒pETduet-His-SOMO-PD-L1(73-739)双酶切鉴定、测序以及保种 | 第29页 |
| 2.2 His-PD-L1蛋白的原核表达 | 第29-32页 |
| 2.2.1 BL21(DE3)感受态细胞的制备 | 第29页 |
| 2.2.2 重组质粒pETduet--His-PD-L1(73-739)转化到BL21(DE3)感受态细胞 | 第29页 |
| 2.2.3 His-PD-L1蛋白的小量表达和表达形式的鉴定 | 第29-30页 |
| 2.2.4 His-PD-L1融合蛋白表达的Western Blotting鉴定 | 第30页 |
| 2.2.5 His-PD-L1融合蛋白的割胶纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.6 His-PD-L1融合蛋白纯化产物Western Blotting鉴定 | 第31-32页 |
| 3 结果分析 | 第32-34页 |
| 3.1 pETduet和PD-L1(73-739)基因片段的双酶切鉴定 | 第32页 |
| 3.2 重组质粒的双酶切鉴定 | 第32-33页 |
| 3.3 重组质粒的测序鉴定 | 第33页 |
| 3.4 His-PD-L1/BL21(DE3)的诱导表达 | 第33-34页 |
| 3.5 His-PD-L1融合蛋白纯化产物的鉴定 | 第34页 |
| 4 讨论 | 第34-36页 |
| 第四章 PD-L1单克隆抗体的制备 | 第36-48页 |
| 1 实验材料、试剂以及主要仪器 | 第36页 |
| 1.1 实验动物以及细胞株 | 第36页 |
| 1.2 试剂与材料 | 第36页 |
| 1.3 试剂的配制 | 第36页 |
| 1.4 主要仪器 | 第36页 |
| 2 方法 | 第36-42页 |
| 2.1 动物免疫 | 第36-38页 |
| 2.1.1 初次免疫免疫原准备 | 第36-37页 |
| 2.1.2 第二次、第三次、第四次免疫免疫原的制备 | 第37页 |
| 2.1.3 加强免疫免疫原的制备 | 第37页 |
| 2.1.4 抗原免疫 | 第37-38页 |
| 2.2 细胞融合 | 第38-40页 |
| 2.2.1 小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0 的培养 | 第38页 |
| 2.2.2 饲养层细胞的准备 | 第38-39页 |
| 2.2.3 脾细胞的制备 | 第39页 |
| 2.2.4 细胞融合 | 第39-40页 |
| 2.3 杂交瘤细胞的筛选与培养 | 第40-42页 |
| 2.3.1 杂交瘤细胞的初筛 | 第40页 |
| 2.3.2 有限稀释法筛选单克隆细胞株 | 第40页 |
| 2.3.3 抗体效价的检测 | 第40-41页 |
| 2.3.4 ELISA法筛选单克隆细胞株 | 第41-42页 |
| 2.4 单克隆抗体腹水抗体的制备 | 第42页 |
| 2.5 抗体的纯化与检测 | 第42页 |
| 2.6 抗体效价检测 | 第42页 |
| 3 结果 | 第42-46页 |
| 3.1 小鼠血清效价结果 | 第42-43页 |
| 3.2 杂交瘤细胞的筛选结果 | 第43-44页 |
| 3.3 Western Blotting检测腹水中抗体 | 第44页 |
| 3.4 单克隆抗体亚型的鉴定 | 第44-45页 |
| 3.5 腹水抗体的纯化 | 第45页 |
| 3.6 纯化的单克隆抗体的效价结果 | 第45-46页 |
| 3.7 Western Blotting检测单克隆抗体特异性 | 第46页 |
| 4 讨论 | 第46-48页 |
| 第五章 PD-L1特异性CAR-T体外活性的检测 | 第48-65页 |
| 1 材料、试剂以及主要的仪器 | 第48页 |
| 1.1 菌种及细胞株 | 第48页 |
| 1.2 试剂 | 第48页 |
| 1.3 主要仪器 | 第48页 |
| 2 方法 | 第48-58页 |
| 2.1 PD-L1特异性CAR基因的构建 | 第48-51页 |
| 2.1.1 杂交瘤细胞株总RNA的提取 | 第48-49页 |
| 2.1.2 合成cDNA | 第49页 |
| 2.1.3 PCR扩增单抗的可变区序列 | 第49-50页 |
| 2.1.4 设计人源化抗PD-L1可变区序列 | 第50-51页 |
| 2.1.5 PD-L1特异性CAR基因的合成 | 第51页 |
| 2.2 质粒的提取与检测 | 第51页 |
| 2.3 293T细胞的复苏与培养 | 第51-52页 |
| 2.3.1 293T细胞的复苏 | 第51-52页 |
| 2.3.2 293T细胞的传代培养 | 第52页 |
| 2.4 携带PD-L1的慢病毒的获得 | 第52-54页 |
| 2.4.1 慢病毒的包装 | 第52-53页 |
| 2.4.2 慢病毒的浓缩 | 第53页 |
| 2.4.3 病毒滴定的测定 | 第53-54页 |
| 2.5 PD-L1特异性CAR-T细胞的构建 | 第54-55页 |
| 2.5.1 PBMC细胞的分离 | 第54页 |
| 2.5.2 CD8+ T细胞的分离 | 第54-55页 |
| 2.5.3 慢病毒感染T细胞 | 第55页 |
| 2.5.4 CAR-T细胞中CAR含量的检测 | 第55页 |
| 2.6 靶细胞的筛选（T细胞目的蛋白的检测） | 第55-56页 |
| 2.7 CAR-T细胞的体外活性检测 | 第56-58页 |
| 2.7.1 非放射性细胞毒性杀伤cyto96检测 | 第56-57页 |
| 2.7.2 ELISA法检测IFN-γ的分泌量 | 第57-58页 |
| 3 结果 | 第58-63页 |
| 3.1 PD-L1单克隆抗体可变区基因测序结果 | 第58-59页 |
| 3.2 pCDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP-CAR重组质粒的双酶切鉴定 | 第59-60页 |
| 3.3 CD8+ T细胞的表型分析 | 第60页 |
| 3.4 293T细胞的转染效率的测定 | 第60-61页 |
| 3.5 病毒滴度的测定 | 第61页 |
| 3.6 病毒感染T细胞CAR的表达率 | 第61-62页 |
| 3.7 靶细胞的筛选 | 第62页 |
| 3.8 非放射性细胞毒性杀伤CytoTox 96 检测 | 第62-63页 |
| 3.9 毒性杀伤上清液中IFN-γ的分泌量 | 第63页 |
| 4 讨论 | 第63-65页 |
| 总结 | 第65页 |
| 展望 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
