| 中文摘要 | 第1-11页 |
| 英文摘要 | 第11-13页 |
| 1 前言 | 第13-25页 |
| ·DHV 的流行及分布 | 第13-14页 |
| ·DHV 的分类地位 | 第14-15页 |
| ·病原学特性 | 第15-16页 |
| ·致病特征 | 第16-17页 |
| ·分子生物学特性 | 第17-20页 |
| ·小RNA 病毒的基因组结构及其功能 | 第17-18页 |
| ·DHV-I 的基因组结构及其功能 | 第18-19页 |
| ·DHV-I 的蛋白结构及其功能 | 第19-20页 |
| ·诊断方法 | 第20-23页 |
| ·病原分离技术 | 第20页 |
| ·中和试验 | 第20-21页 |
| ·琼脂扩散试验 | 第21页 |
| ·凝集试验 | 第21-22页 |
| ·荧光抗体试验 | 第22页 |
| ·胶体金技术 | 第22页 |
| ·酶联免疫吸附试验 | 第22页 |
| ·分子生物学诊断技术 | 第22-23页 |
| ·单克隆抗体技术 | 第23页 |
| ·本实验目的意义 | 第23-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-42页 |
| ·实验材料 | 第25-29页 |
| ·毒株与载体 | 第25-27页 |
| ·实验胚、动物与细胞 | 第27页 |
| ·工具酶及生化试剂 | 第27页 |
| ·主要试剂的配置 | 第27-28页 |
| ·仪器设备 | 第28-29页 |
| ·引物的合成 | 第29页 |
| ·实验方法 | 第29-42页 |
| ·目的基因的克隆 | 第29-31页 |
| ·病毒RNA 提取 | 第29-30页 |
| ·病毒cDNA 获得 | 第30页 |
| ·目的基因RT-PCR 扩增 | 第30页 |
| ·PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定及VP1 基因片段的回收 | 第30-31页 |
| ·VP1 基因的鉴定 | 第31-32页 |
| ·VP1 基因与T 载体的链接 | 第31页 |
| ·连接产物的转化 | 第31-32页 |
| ·阳性转化子筛选与鉴定 | 第32页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第32-33页 |
| ·pET-30a 表达载体的制备 | 第32-33页 |
| ·带有粘性末端目的基因的制备 | 第33页 |
| ·连接与转化 | 第33页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第33页 |
| ·重组阳性质粒转化表达菌株 | 第33页 |
| ·融合蛋白表达 | 第33-35页 |
| ·构建pET30a-VP1 质粒的表达条件 | 第33-34页 |
| ·融合蛋白SDS-PAGE 分析 | 第34页 |
| ·融合蛋白Western-blot 检测 | 第34-35页 |
| ·免疫原的制备 | 第35-36页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第35-36页 |
| ·纯化蛋白的SDS-PAGE 分析及Western-blot 检测 | 第36页 |
| ·间接ELISA 检测方法的初步建立 | 第36-37页 |
| ·抗原蛋白、一抗及酶标抗体工作浓度的确定 | 第36页 |
| ·检测方法的准确率测试 | 第36-37页 |
| ·单克隆抗体的制备 | 第37-39页 |
| ·小鼠免疫 | 第37页 |
| ·免疫小鼠血清效价的测定 | 第37页 |
| ·饲养层细胞的制备 | 第37页 |
| ·骨髓瘤细胞的制备 | 第37-38页 |
| ·脾细胞的制备 | 第38页 |
| ·细胞融合 | 第38页 |
| ·杂交瘤细胞的筛选 | 第38页 |
| ·阳性杂交瘤细胞的克隆 | 第38-39页 |
| ·阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏 | 第39页 |
| ·杂交瘤细胞的冻存 | 第39页 |
| ·杂交瘤细胞的复苏 | 第39页 |
| ·杂交瘤细胞的鉴定 | 第39页 |
| ·杂交瘤细胞稳定性试验 | 第39页 |
| ·杂交瘤细胞上清western-blot 鉴定 | 第39页 |
| ·单克隆抗体的鉴定 | 第39-42页 |
| ·单抗腹水的制备 | 第39-40页 |
| ·单克隆抗体亚型鉴定 | 第40页 |
| ·单克隆抗体腹水效价测定 | 第40页 |
| ·单克隆抗体Dot-ELISA 检测 | 第40页 |
| ·单克隆抗体特异性鉴定 | 第40-42页 |
| 3 结果与分析 | 第42-50页 |
| ·目的基因RT-PCR 鉴定结果 | 第42页 |
| ·重组表达质粒的鉴定 | 第42-43页 |
| ·融合蛋白表达与纯化蛋白鉴定 | 第43-44页 |
| ·间接ELISA 检测方法优化 | 第44-45页 |
| ·杂交瘤细胞的筛选结果 | 第45-46页 |
| ·免疫小鼠血清效价测定 | 第45-46页 |
| ·阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆化 | 第46页 |
| ·阳性杂交瘤细胞的鉴定结果 | 第46-47页 |
| ·稳定性鉴定结果 | 第46页 |
| ·Western-blot 鉴定结果 | 第46-47页 |
| ·单克隆抗体的鉴定结果 | 第47-50页 |
| ·单抗亚型测定 | 第47页 |
| ·单抗腹水效价测定 | 第47-48页 |
| ·Dot-ELISA 检测结果 | 第48页 |
| ·免疫荧光检测结果 | 第48-50页 |
| 4 讨论 | 第50-53页 |
| ·表达条件的优化 | 第50页 |
| ·单克隆抗体制备 | 第50-52页 |
| ·ELISA 检测方法的优化 | 第52页 |
| ·单抗特异性检测 | 第52-53页 |
| 5 结论 | 第53-54页 |
| 致谢 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-61页 |
| 附录 | 第61-63页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第63页 |