| 中文摘要 | 第1-17页 |
| 英文摘要 | 第17-21页 |
| 第一部分 文献综述 | 第21-43页 |
| ·昆虫病原真菌在生物农药中的重要性 | 第21-22页 |
| ·昆虫体壁降解酶在昆虫病原真菌侵染宿主过程中的作用 | 第22-28页 |
| ·昆虫病原真菌的侵染过程 | 第22-24页 |
| ·侵染过程中体壁降解酶的作用 | 第24-28页 |
| ·蛋白酶 | 第24-26页 |
| ·蛋白酶产生的调节 | 第25页 |
| ·蛋白酶对昆虫病原真菌毒力的影响 | 第25-26页 |
| ·几丁质酶 | 第26-28页 |
| ·几丁质酶对昆虫病原真菌毒力的影响 | 第27页 |
| ·几丁质酶的三维结构 | 第27-28页 |
| ·几丁质结合域 | 第28-32页 |
| ·几丁质结合域的三维结构 | 第29-30页 |
| ·几丁质结合域的功能 | 第30-31页 |
| ·几丁质结合域的缺失研究 | 第31-32页 |
| ·蛋白质的定向进化 | 第32-38页 |
| ·定点突变 | 第33页 |
| ·DNA shuffling | 第33-37页 |
| ·单基因shuffling | 第33-34页 |
| ·基因家族shuffling | 第34页 |
| ·其它的一些shuffling方法 | 第34-35页 |
| ·基于非同源序列的定向进化 | 第35-36页 |
| ·DNA shuffling的应用 | 第36-37页 |
| ·结构域融合技术 | 第37-38页 |
| ·异源蛋白表达系统 | 第38-43页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第38-41页 |
| ·异源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达 | 第38-39页 |
| ·异源蛋白的融合表达 | 第39-40页 |
| ·异源蛋白的分泌表达 | 第40-41页 |
| ·酵母表达系统 | 第41-43页 |
| 第二部分 引言 | 第43-46页 |
| 第三部分 利用DNA shuffling技术提高球孢白僵菌几丁质酶Bbchit1的活性 | 第46-72页 |
| ·材料 | 第46-49页 |
| ·菌株与试剂 | 第46页 |
| ·仪器 | 第46-47页 |
| ·主要培养基和缓冲液 | 第47-49页 |
| ·本部分使用的引物序列 | 第49页 |
| ·方法 | 第49-58页 |
| ·Bbchit1在大肠杆菌中的表达分析 | 第49-52页 |
| ·Bbchit1原核表达载体的构建 | 第49-50页 |
| ·Bbchit1的表达分析 | 第50页 |
| ·Bbchit1的纯化及复性 | 第50-51页 |
| ·Western blot | 第51页 |
| ·几丁质酶活性分析 | 第51-52页 |
| ·GlcNAc标准曲线的制定 | 第52页 |
| ·Bbchit1定性分析 | 第52页 |
| ·不同条件对Bbchit1分泌表达的影响 | 第52-54页 |
| ·不同信号肽的获得 | 第52-53页 |
| ·具不同信号肽Bbchit1原核表达载体的构建 | 第53页 |
| ·不同信号肽对Bbchit1分泌表达的影响 | 第53-54页 |
| ·不同IPTG浓度对Bbchit1分泌的影响 | 第54页 |
| ·周质空间Bbchit1的纯化 | 第54页 |
| ·Bbchit1的shuffling | 第54-55页 |
| ·易错PCR | 第54页 |
| ·DNaseI消化及小片段的组装 | 第54-55页 |
| ·组装后目的片段的扩增及筛选 | 第55页 |
| ·大肠杆菌的电击转化 | 第55页 |
| ·突变体分析 | 第55-56页 |
| ·几丁质酶的纯化 | 第55页 |
| ·突变体的酶动力学分析 | 第55页 |
| ·最适pH和最适温度分析 | 第55-56页 |
| ·突变体的二级结构分析 | 第56页 |
| ·组成性表达突变基因对球孢白僵菌毒力的影响 | 第56-58页 |
| ·真菌表达载体的构建 | 第56页 |
| ·球孢白僵菌的转化及筛选 | 第56-57页 |
| ·转化子的几丁质酶活性分析 | 第57页 |
| ·转化子的PCR验证 | 第57页 |
| ·毒力分析 | 第57-58页 |
| ·结果与分析 | 第58-69页 |
| ·Bbchit1在大肠杆菌中的表达分析 | 第58-64页 |
| ·Bbchit1原核表达载体的构建 | 第58页 |
| ·Bbchit1在大肠杆菌中的诱导表达 | 第58-59页 |
| ·IPTG浓度和诱导时间对Bbchit1表达量的影响 | 第59-60页 |
| ·Bbchit1的纯化、复性及生物活性分析 | 第60-61页 |
| ·不同信号肽及温度对Bbchit1分泌表达的影响 | 第61-63页 |
| ·IPTG浓度对Bbchit1分泌表达的影响 | 第63-64页 |
| ·Bbchit1的DNA shuffling | 第64-68页 |
| ·DNaseI消化及组装 | 第64页 |
| ·突变体库的筛选 | 第64-65页 |
| ·突变体的序列及活性分析 | 第65-66页 |
| ·酶学特性分析 | 第66-67页 |
| ·突变体的二级结构分析 | 第67-68页 |
| ·组成性表达shu-1和shu-2对球孢白僵菌毒力的影响 | 第68-69页 |
| ·讨论 | 第69-71页 |
| ·几丁质酶在大肠杆菌中的表达 | 第69-70页 |
| ·Bbchit1的shuffling | 第70-71页 |
| ·小结 | 第71-72页 |
| 第四部分 不同来源几丁质结合域的筛选、融合几丁酶的特性与重组菌株的毒力分析 | 第72-112页 |
| ·材料与试剂 | 第72-74页 |
| ·方法 | 第74-84页 |
| ·Bbchit1在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第74-77页 |
| ·Bbchit1毕赤酵母表达载体的构建 | 第74-75页 |
| ·毕赤酵母的转化 | 第75-77页 |
| ·重组表达质粒的提取 | 第75页 |
| ·质粒的线性化及去磷酸化处理 | 第75页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备及筛选 | 第75-76页 |
| ·酵母转化子的G418筛选 | 第76页 |
| ·酵母转化子的表型分析 | 第76页 |
| ·表达分析 | 第76-77页 |
| ·Bbchit1的纯化 | 第77页 |
| ·融合几丁质酶的构建、表达及纯化 | 第77-80页 |
| ·几丁质结合域的收集 | 第77-79页 |
| ·家蚕几丁质酶几丁质结合域(BmChBD)的获得 | 第77页 |
| ·云杉蚜虫几丁质酶几丁质结合域(CfChBD)的获得 | 第77-78页 |
| ·苦瓜几丁质酶几丁质结合域(McChBD)的获得 | 第78页 |
| ·环状芽孢杆菌几丁质酶几丁质结合域(BcChBD)的获得 | 第78页 |
| ·果蝇围食膜结合蛋白几丁质结合域的获得(DmChBD) | 第78页 |
| ·家蚕几丁质酶几丁质结合域的突变分析 | 第78-79页 |
| ·融合几丁质酶酵母表达载体的构建 | 第79-80页 |
| ·融合几丁质酶在巴斯德毕赤酵母中的表达及纯化 | 第80页 |
| ·融合几丁质酶的酶学特性分析 | 第80-82页 |
| ·融合几丁质酶与不同底物的结合分析 | 第80页 |
| ·融合几丁质酶的FITC标记 | 第80页 |
| ·几丁质酶活性测定 | 第80页 |
| ·融合几丁质酶酶动力学常数测定 | 第80-81页 |
| ·融合几丁质酶的最适pH与最适温度分析 | 第81页 |
| ·融合几丁质酶的热稳定性分析 | 第81页 |
| ·几丁质酶对昆虫体壁的作用 | 第81页 |
| ·样品处理 | 第81页 |
| ·扫描电镜样品的制备 | 第81页 |
| ·几丁质酶对几丁质寡糖的降解模式研究 | 第81-82页 |
| ·几丁质寡糖的完整性检测 | 第82页 |
| ·样品处理 | 第82页 |
| ·融合几丁质酶表达载体构建及球孢白僵菌转化 | 第82页 |
| ·融合基因的构建 | 第82页 |
| ·单独家蚕几丁质结合域的扩增(在N端引入起始密码子) | 第82页 |
| ·真菌表达载体的构建 | 第82页 |
| ·球孢白僵菌转化子的几丁质酶活性分析 | 第82页 |
| ·转化子的PCR验证 | 第82-83页 |
| ·转化子的Northern blot分析 | 第83-84页 |
| ·真菌RNA的提取 | 第83页 |
| ·Northern blot | 第83-84页 |
| ·转化子的Western blot分析 | 第84页 |
| ·转化子的毒力分析 | 第84页 |
| ·结果与分析 | 第84-108页 |
| ·几丁质酶Bbchit1在毕赤酵母中的表达 | 第84-87页 |
| ·Bbchit1酵母表达载体的构建 | 第84-85页 |
| ·重组质粒转化毕赤酵母及筛选 | 第85-86页 |
| ·Bbchit1的诱导表达 | 第86页 |
| ·Bbchit1的脱盐层析 | 第86-87页 |
| ·融合几丁质酶的构建及表达 | 第87-94页 |
| ·几丁质结合域的获得 | 第87-89页 |
| ·家蚕几丁质酶几丁质结合域的突变分析 | 第89-91页 |
| ·融合几丁质酶的构建 | 第91-93页 |
| ·融合几丁质酶在毕赤酵母中的表达与纯化 | 第93-94页 |
| ·融合几丁质酶的酶学特性分析 | 第94-102页 |
| ·融合几丁质酶与几丁质的结合分析 | 第94-96页 |
| ·FITC-一几丁质酶与几丁质的结合 | 第96-97页 |
| ·融合几丁质酶的热稳定性分析 | 第97-98页 |
| ·融合几丁质酶的最适反应温度和pH分析 | 第98页 |
| ·融合几丁质酶的酶动力学分析 | 第98页 |
| ·融合几丁质酶的酶活分析 | 第98-100页 |
| ·几丁质寡糖的降解产物分析 | 第100-101页 |
| ·几丁质酶对昆虫体壁的降解作用 | 第101-102页 |
| ·组成性表达融合几丁质酶基因对球孢白僵菌毒力的影响 | 第102-108页 |
| ·融合几丁质酶组成性表达载体的构建 | 第102-105页 |
| ·转化子的几丁质酶活性分析 | 第105页 |
| ·转化子的分子验证 | 第105-107页 |
| ·毒力测定 | 第107-108页 |
| ·讨论 | 第108-110页 |
| ·几丁质酶在酵母中表达分析 | 第108-109页 |
| ·融合几丁质酶的酶学特性分析 | 第109-110页 |
| ·融合几丁质酶与几丁质底物的结合分析 | 第109页 |
| ·融合几丁质酶的热稳定性分析 | 第109-110页 |
| ·融合几丁质酶对球孢白僵菌毒力的影响 | 第110页 |
| ·小结 | 第110-112页 |
| 第五部分 在类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1上添加几丁质结合域对球孢白僵菌毒力的影响 | 第112-139页 |
| ·材料与试剂 | 第112页 |
| ·方法 | 第112-117页 |
| ·CDEP-1在毕赤酵母中的表达、纯化 | 第112-114页 |
| ·CDEP-1酵母表达载体的构建 | 第112-113页 |
| ·转化与筛选 | 第113页 |
| ·His~+Mut~+与His~+Mut~-表型筛选 | 第113页 |
| ·CDEP-1的表达分析 | 第113页 |
| ·蛋白酶活性检测 | 第113-114页 |
| ·CDEP-1的纯化 | 第114页 |
| ·CDEP-1的Western blot分析 | 第114页 |
| ·融合蛋白酶的构建及其在毕赤酵母中的表达 | 第114-115页 |
| ·融合蛋白酶酵母表达载体的构建 | 第114-115页 |
| ·融合蛋白酶在毕赤酵母中的表达及纯化 | 第115页 |
| ·融合蛋白酶的酶学特性分析 | 第115-116页 |
| ·最适pH分析 | 第115页 |
| ·融合蛋白酶与几丁质底物的结合分析 | 第115页 |
| ·融合蛋白酶对昆虫体壁的降解及与几丁质酶的协同作用 | 第115-116页 |
| ·融合蛋白酶对蚜虫体壁降解的电镜观察 | 第116页 |
| ·融合蛋白酶作为添加剂对球孢白僵菌毒力的影响 | 第116-117页 |
| ·融合蛋白酶表达载体构建及球孢白僵菌转化 | 第117页 |
| ·载体构建及转化 | 第117页 |
| ·转化子分析 | 第117页 |
| ·结果 | 第117-136页 |
| ·pPIC9K-CDEP-1载体构建 | 第117-118页 |
| ·毕赤酵母转化子的筛选 | 第118-119页 |
| ·CDEP-1的诱导表达 | 第119页 |
| ·CDEP-1的纯化及检测 | 第119-120页 |
| ·Western blot检测 | 第120页 |
| ·融合蛋白酶基因的获得及其在毕赤酵母中的表达及纯化 | 第120-123页 |
| ·融合蛋白酶的最适pH分析 | 第123-124页 |
| ·蛋白酶与不溶性几丁质底物的结合分析 | 第124-125页 |
| ·融合蛋白酶对昆虫体壁的降解及对几丁质酶活性的影响 | 第125-126页 |
| ·融合蛋白酶对蚜虫体壁的降解 | 第126-127页 |
| ·融合蛋白酶作为添加剂对球孢白僵菌毒力的影响 | 第127-130页 |
| ·组成性表达融合蛋白酶对球孢白僵菌毒力的影响 | 第130-136页 |
| ·融合蛋白酶组成性表达载体的构建 | 第130-133页 |
| ·转化子分析 | 第133-135页 |
| ·毒力分析 | 第135-136页 |
| ·讨论 | 第136-137页 |
| ·蛋白酶在毕赤酵母中的表达 | 第136页 |
| ·融合蛋白酶的酶学特性分析 | 第136-137页 |
| ·融合蛋白酶对球孢白僵菌毒力的影响 | 第137页 |
| ·小结 | 第137-139页 |
| 第六部分 结论 | 第139-142页 |
| 参考文献 | 第142-154页 |
| 附录1 文中缩写 | 第154-156页 |
| 附录2 攻读博士学位期间撰写和发表论文、专利申请情况 | 第156-157页 |
| 致谢 | 第157-158页 |
