| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略语 | 第8-13页 |
| 第一部分 文献综述与实验设计 | 第13-26页 |
| 第一章 Bombyxin的研究进展 | 第14-24页 |
| 1.前言 | 第14-20页 |
| ·Bbx-b4 基因结构 | 第15-16页 |
| ·Bbx-b4 蛋白结构及功能 | 第16-18页 |
| ·研究及展望 | 第18-20页 |
| 2 杆状病毒表达系统研究进展 | 第20-24页 |
| ·杆状病毒的分类及形态特征 | 第20页 |
| ·昆虫杆状病毒表达载体系统的研究进展 | 第20-22页 |
| ·Bac-to-Bac 杆状病毒表达载体系统简介 | 第22页 |
| ·杆状病毒多角体蛋白的概述及研究进展 | 第22-24页 |
| 第二章 实验设计方案 | 第24-26页 |
| 1 实验目的和意义 | 第24页 |
| 2 本实验的主要研究内容 | 第24-25页 |
| 3 实验流程 | 第25-26页 |
| 第二部分 研究论文 | 第26-71页 |
| 第一章 家蚕Bbx-b4基因的克隆与原核表达 | 第27-42页 |
| 1 材料与试剂 | 第27-30页 |
| ·材料 | 第27页 |
| ·试剂 | 第27页 |
| ·主要试剂的配制 | 第27-30页 |
| 2 方法 | 第30-37页 |
| ·Polh 基因的克隆 | 第30-34页 |
| ·特异性引物的合成 | 第30-31页 |
| ·PCR 产物的纯化 | 第31页 |
| ·PCR 产物与表达载体 pET-28a 的双酶切 | 第31页 |
| ·酶切产物处理及回收 | 第31页 |
| ·连接反应 | 第31-32页 |
| ·E. coli TG1、BL21(DE3)感受态细胞的制备（CaCl2法） | 第32页 |
| ·连接产物的转化 | 第32-33页 |
| ·重组克隆的筛选与鉴定 | 第33-34页 |
| ·构建重组载体 pET-28a-Polh-Bbx-b422 | 第34-35页 |
| ·PCR 获得 Bbx-b4 的 ORF 序列 | 第34页 |
| ·PCR 产物的纯化 | 第34-35页 |
| ·双酶切 Bbx-b4 的 PCR 片段与重组表达载体 pET-28a-Polh 并回收 | 第35页 |
| ·连接反应 | 第35页 |
| ·E. coli TG1、BL21 (DE3)感受态细胞的制备（CaCl2法） | 第35页 |
| ·连接产物的转化 | 第35页 |
| ·融合基因 Polh-Bbx-b4 的表达 | 第35-37页 |
| ·重组 pET-28a-Polh-Bbx-b4 质粒的筛选与鉴定 | 第35-37页 |
| ·重组质粒 pET-28a-Polh-Bbx-b4 的表达与鉴定 | 第37页 |
| 3 结果 | 第37-41页 |
| ·Polh 基因的 PCR 扩增 | 第37-38页 |
| ·Bbx-b4 基因的 PCR 扩增 | 第38页 |
| ·重组质粒 pET-28a-Polh 的 PCR 和双酶切鉴定 | 第38-39页 |
| ·重组质粒 pET-28a-Polh-Bbx-b4 的鉴定 | 第39-40页 |
| ·序列测定 | 第40页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第40-41页 |
| 4 讨论 | 第41-42页 |
| 第二章 重组蛋白的纯化和多克隆抗体的制备 | 第42-54页 |
| 1 材料与试剂 | 第42-45页 |
| ·材料 | 第42页 |
| ·订购试剂 | 第42页 |
| ·主要试剂的配制 | 第42-45页 |
| 2 方法 | 第45-49页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第45-46页 |
| ·重组蛋白的大量表达与包涵体的洗涤 | 第45页 |
| ·调节缓冲液 pH 值纯化 Polh-Bbx-b433 | 第45-46页 |
| ·Ni-NTA 柱纯化重组蛋白 | 第46页 |
| ·多克隆抗体的制备及纯化 | 第46-49页 |
| ·抗原的制备 | 第46-47页 |
| ·免疫新西兰雄兔 | 第47页 |
| ·多克隆抗血清的制备 | 第47页 |
| ·抗体的纯化 | 第47-48页 |
| ·间接 ELISA 法测定抗体的效价 | 第48-49页 |
| ·Western blotting 检测抗体特异性 | 第49页 |
| 3 结果 | 第49-52页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第49-50页 |
| ·多克隆抗体的纯化 | 第50-51页 |
| ·间接 ELISA 法测定抗体效价 | 第51-52页 |
| ·Western blotting 检测抗体的特异性 | 第52页 |
| 4 讨论 | 第52-54页 |
| 第三章 蚕素Bbx-b4基因的真核表达及其功能研究 | 第54-66页 |
| 1 材料与试剂 | 第54-56页 |
| ·材料 | 第54页 |
| ·试剂 | 第54页 |
| ·自配试剂 | 第54-56页 |
| 2 方法 | 第56-61页 |
| ·重组 Bacmid-Bbx-b4 的构建 | 第56-59页 |
| ·pFastBac1 质粒的提取 | 第56页 |
| ·目的 Bbx-b4 基因的获得 | 第56页 |
| ·pFastBac1 质粒和目的基因的双酶切与回收 | 第56页 |
| ·BmDH10Bac E.coli 的感受态细胞制备 | 第56-57页 |
| ·重组质粒的转化 | 第57页 |
| ·重组 BmBacmid DNA 的提取 | 第57-58页 |
| ·重组 BmBacmid 的 PCR 鉴定 | 第58-59页 |
| ·家蚕 BmN 细胞表达融合蛋白 | 第59-61页 |
| ·重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕 BmN 细胞 | 第59页 |
| ·重组病毒的鉴定 | 第59页 |
| ·重组病毒基因组 PCR 鉴定 | 第59页 |
| ·杆状病毒的扩大化 | 第59页 |
| ·融合基因在家蚕蛹中的表达 | 第59-60页 |
| ·融合基因在家蚕细胞和蚕蛹中的表达鉴定 | 第60页 |
| ·重组病毒提取及鉴定 | 第60页 |
| ·融合蛋白的 Western blotting 检测 | 第60-61页 |
| 3 结果 | 第61-64页 |
| ·Bbx-b4 全序列的 PCR 扩增 | 第61-62页 |
| ·重组质粒 pFastBac1-Bbx-b4 的 PCR 和双酶切鉴定 | 第62-63页 |
| ·重组质粒 pFastBac1 测序结果 | 第63页 |
| ·重组质粒 pFast-Bbx-b4 与 E.coli BmDH10Bac1 中 BmBacmid 转座重组及鉴定 | 第63页 |
| ·重组病毒基因组的 PCR 鉴定 | 第63-64页 |
| ·融合目的蛋白在家蚕细胞中表达的鉴定 | 第64页 |
| 4 讨论 | 第64-66页 |
| 第四章 Bbx-b4生物活性分析 | 第66-71页 |
| 1 材料与试剂 | 第66页 |
| ·材料 | 第66页 |
| ·试剂 | 第66页 |
| 2 方法 | 第66-67页 |
| ·流式细胞仪检测细胞周期 | 第66-67页 |
| ·小鼠降血糖活性分析 | 第67页 |
| ·四氧嘧啶（ALX）致小鼠高血糖模型的制备 | 第67页 |
| ·含目的蛋白的蚕蛹粉对高血糖动物模型的降血糖作用 | 第67页 |
| 3 结果分析 | 第67-69页 |
| ·Bbx-b4 蚕素原对 BmN 细胞周期的影响 | 第67-68页 |
| ·四氧嘧啶造模 72 h 后各组血糖值 | 第68-69页 |
| ·Bbx-b4 的降血糖活性分析 | 第69页 |
| 4 讨论 | 第69-71页 |
| 结论 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
