| 中文摘要 | 第1-9页 |
| 英文摘要 | 第9-12页 |
| 前言 | 第12-22页 |
| 1.靶向性基因治疗 | 第12-13页 |
| 2.嵌合体修复术 | 第13-16页 |
| 3.嵌合体修复术与β-地贫的基因治疗 | 第16-21页 |
| 4.本研究的课题设计 | 第21-22页 |
| 材料与方法 | 第22-41页 |
| 一、材料 | 第22-24页 |
| 1.菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.细胞系、脐带血 | 第22页 |
| 3.限制性内切酶及其它酶类 | 第22页 |
| 4.各种转染试剂 | 第22页 |
| 5.寡核苷酸 | 第22-23页 |
| 6.细胞因子及抗体 | 第23页 |
| 7.其它主要试剂及试剂盒 | 第23页 |
| 8.主要仪器 | 第23页 |
| 9.放射性核素 | 第23-24页 |
| 二、实验方法 | 第24-41页 |
| 1.实验流程图 | 第24-25页 |
| 2.质粒的构建 | 第25-28页 |
| ·聚乙二醇(PEG)回收DNA片段 | 第25页 |
| ·凝胶回收试剂盒回收DNA片段 | 第25-26页 |
| ·DNA片段3′凹端的补平 | 第26页 |
| ·DNA片段3′凸端的削平 | 第26页 |
| ·载体的脱磷酸化 | 第26页 |
| ·连接反应 | 第26-27页 |
| ·感受态大肠杆菌细胞制备 | 第27页 |
| ·转化 | 第27页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第27页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第27-28页 |
| ·荧光测序 | 第28页 |
| 3.哺乳动物细胞系及脐带血CD34~+细胞的分离和培养 | 第28-30页 |
| ·细胞培养 | 第28页 |
| ·G418溶液配制 | 第28页 |
| ·细胞传代及冻存 | 第28-29页 |
| ·细胞复苏 | 第29页 |
| ·Hemine诱导K562、HEL细胞分化 | 第29页 |
| ·从人脐血中分离CD34~+造血干／祖细胞 | 第29页 |
| ·CD34~+细胞含量检测 | 第29页 |
| ·CD34~+造血干／祖细胞集落形成实验 | 第29-30页 |
| ·2.2％甲基纤维素溶液的配制 | 第30页 |
| ·集落形成分析 | 第30页 |
| 4.细胞转染 | 第30-33页 |
| ·电穿孔法转染DNA | 第30页 |
| ·脂质体介导的基因转染 | 第30-32页 |
| ·Lipofectamine 2000法转染 | 第30-31页 |
| ·DOTAP介导的基因转染 | 第31-32页 |
| ·DIRIE-C介导的基因转染 | 第32页 |
| ·Gene Jammer介导的基因转染 | 第32-33页 |
| ·PEI介导的基因转染 | 第33页 |
| 5.利用荧光素酶分析系统测定转染效率 | 第33-34页 |
| ·转染细胞的裂解 | 第33页 |
| ·贴壁细胞的裂解 | 第33页 |
| ·悬浮细胞的裂解 | 第33页 |
| ·荧光素酶的检测 | 第33-34页 |
| 6.Southern blot分析 | 第34-35页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第34页 |
| ·Southern印迹分析 | 第34-35页 |
| ·酶解 | 第34页 |
| ·电泳 | 第34页 |
| ·Southern转移 | 第34页 |
| ·预杂交 | 第34页 |
| ·DNA探针标记 | 第34-35页 |
| ·杂交 | 第35页 |
| ·洗膜及放射自显影 | 第35页 |
| 7.哺乳动物RNA的Northern分析 | 第35-36页 |
| ·从哺乳动物细胞中分离总RNA | 第35页 |
| ·RNA在甲醛变性胶上电泳 | 第35-36页 |
| ·RNA样品处理 | 第36页 |
| ·电泳及转膜 | 第36页 |
| ·探针标记及杂交 | 第36页 |
| 8.PCR扩增待检测片段 | 第36-37页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第36页 |
| ·从哺乳动物细胞中分离高分子量的基因组DNA | 第36页 |
| ·细胞裂解法分离基因组DNA | 第36页 |
| ·PCR反应引物的设计及序列 | 第36-37页 |
| 9.限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)分析寡核苷酸的定点突变作用 | 第37-38页 |
| 10.等位基因特异PCR检测寡核苷酸的定点突变作用 | 第38页 |
| 11.定点突变克隆的筛选 | 第38页 |
| 12.半定量RT-PCR检测突变K562、HEL细胞中人γ-珠蛋白基因的表达水平 | 第38-39页 |
| ·从转染的细胞中提取细胞总RNA | 第39页 |
| ·反转录成cDNA第一链 | 第39页 |
| ·半定量RT-PCR | 第39页 |
| 13.酸性解链电泳检测经诱导的K562、HEL细胞中的珠蛋白 | 第39-41页 |
| ·血红蛋白的提取 | 第39页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶的配制 | 第39-40页 |
| ·上样、电泳与凝胶处理 | 第40-41页 |
| 实验结果 | 第41-69页 |
| Ⅰ.EGFP荧光报告系统的构建 | 第41-53页 |
| 一、突变EGFP基因(mEGFP)的获得及真核表达质粒的构建 | 第41-45页 |
| 1.用PCR的方法获得突变基因 | 第41页 |
| 2.突变EGFP基因(mEGFP)的序列分析 | 第41页 |
| 3.pmEGFP真核表达载体的构建 | 第41-45页 |
| 二、HeLa-mEGFP细胞株的建立 | 第45-46页 |
| 三、mEGFP基因的定点纠错 | 第46-53页 |
| 1.针对mEGFP基因的点突变的打靶分子的设计 | 第46页 |
| 2.FAM标记的寡核苷酸转染细胞实验 | 第46-48页 |
| 3.RDO介导的基因定点纠错 | 第48页 |
| 4.硫代磷酸酯修饰的单链DNA寡核苷酸介导的基因定点纠错 | 第48-53页 |
| ·流式分析E3-F5、E6-F5发光细胞的含量 | 第48页 |
| ·流式分选的发光细胞DNA水平的分析 | 第48-51页 |
| ·转染时寡核苷酸的量与纠正效率的关系分析 | 第51-53页 |
| Ⅱ.Gγ基因调控序列的定点突变 | 第53-69页 |
| 1.针对Gγ基因启动子-202 C→G突变的打靶分子的设计 | 第53-54页 |
| 2.脐血CD34~+造血干／祖细胞的分离、体外培养及功能检测 | 第54-57页 |
| ·免疫磁珠法分离CD34~+造血干／祖细胞 | 第54页 |
| ·CD34~+造血干／祖细胞的体外培养 | 第54页 |
| ·造血干／祖细胞集落形成实验 | 第54-57页 |
| 3.FAM标记的寡核苷酸转染细胞实验 | 第57-59页 |
| 4.PCR-RFLP分析寡核苷酸的定点突变作用 | 第59-63页 |
| 5.PCR产物序列分析 | 第63页 |
| 6.硫代磷酸酯修饰的SDO转染的K562细胞Southern杂交分析 | 第63-65页 |
| 7.半定量RT-PCR检测SDO定点突变的K562中γ-基因的表达 | 第65-66页 |
| 8.酸性解链电泳测定珠蛋白含量 | 第66-67页 |
| 9.硫代磷酸酯修饰的SDO转染K562细胞的突变率曲线 | 第67-68页 |
| 10.SDO-49对K562细胞的定点突变作用 | 第68页 |
| 11.定点突变克隆的筛选 | 第68-69页 |
| 讨论 | 第69-74页 |
| 一、影响嵌合体修复术定点纠错效率的因素 | 第69-71页 |
| 二、基因定点纠错报告系统的比较 | 第71-72页 |
| 三、嵌合体修复术的应用前景 | 第72-74页 |
| 小结 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-79页 |
| 文献综述 | 第79-90页 |
| 英文名词及缩写 | 第90-91页 |
| 致谢 | 第91-92页 |
| 个人简历 | 第92页 |
