| 目录 | 第1-13页 |
| 摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-18页 |
| 名词缩写表 | 第18-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-52页 |
| 1 基因工程表达系统研究进展 | 第19-34页 |
| ·原核表达系统及其应用 | 第19-20页 |
| ·真核表达系统及其应用 | 第20-30页 |
| ·丝状真菌表达系统 | 第20页 |
| ·植物表达系统 | 第20-21页 |
| ·昆虫表达系统 | 第21页 |
| ·哺乳动物表达系统 | 第21-22页 |
| ·酵母表达系统 | 第22-30页 |
| ·食品级表达系统研究进展 | 第30-34页 |
| ·食品级表达系统的提出和定义 | 第30页 |
| ·食品级表达系统研究进展 | 第30-31页 |
| ·食品级酵母表达系统的构建 | 第31-34页 |
| 2 GAL基因家族调控系统和外源基因的表达 | 第34-39页 |
| ·GAL基因的结构和功能 | 第34-37页 |
| ·GAL基因的调控机制 | 第37页 |
| ·GAL基因和外源蛋白的表达 | 第37-39页 |
| 3 酵母细胞表面展示技术(Yeast Surface Display,YSD) | 第39-47页 |
| ·酵母细胞表面展示表达系统构成 | 第40-41页 |
| ·载体 | 第40页 |
| ·外源表达蛋白 | 第40页 |
| ·宿主菌株 | 第40-41页 |
| ·几种酵母细胞表面展示表达系统 | 第41-42页 |
| ·凝集素展示表达系统 | 第41-42页 |
| ·絮凝素展示表达系统 | 第42页 |
| ·其它酿酒酵母表面展示表达系统(表1-4) | 第42页 |
| ·酿酒酵母细胞表面展示表达系统应用 | 第42-47页 |
| ·展示表达各种酶蛋白作为生物催化剂 | 第43-45页 |
| ·环境治理中展示表达金属蛋白 | 第45页 |
| ·蛋白质分子的相互作用及组合蛋白库的构建 | 第45-46页 |
| ·可作为生物传感器的荧光蛋白的展示表达 | 第46页 |
| ·免疫学中的应用 | 第46-47页 |
| ·目前酿酒酵母表面展示表达系统存在的缺陷 | 第47页 |
| 4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶研究进展 | 第47-50页 |
| ·p-1,3-1,4-葡聚糖酶的来源 | 第47-48页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶分子生物学研究进展 | 第48-49页 |
| ·编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因以及酶基因的改造和表达 | 第48页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶的生物化学性质 | 第48-49页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶的结构和功能研究 | 第49-50页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶在工业生产中的应用 | 第50页 |
| ·在啤酒工业中的应用 | 第50页 |
| ·在饲料工业中的应用 | 第50页 |
| 5 选题背景和研究内容 | 第50-52页 |
| ·选题背景 | 第50-51页 |
| ·研究内容 | 第51-52页 |
| 第二章 酵母染色体GAL1基因敲除和双重GAL4基因构建 | 第52-70页 |
| 1 材料与方法 | 第52-59页 |
| ·材料、主要试剂及仪器设备 | 第52-54页 |
| ·菌株和质粒 | 第52-53页 |
| ·培养基 | 第53页 |
| ·主要试剂及其配制 | 第53页 |
| ·主要仪器和设备 | 第53-54页 |
| ·实验方法 | 第54-59页 |
| ·酵母基因组提取 | 第54页 |
| ·PCR条件 | 第54-55页 |
| ·质粒的提取 | 第55-56页 |
| ·酶切和连接 | 第56页 |
| ·PCR片段和T载体的连接 | 第56页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第56-57页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备和转化 | 第57页 |
| ·质粒的快速鉴定 | 第57页 |
| ·DNA乙醇沉淀 | 第57-58页 |
| ·酿酒酵母感受态细胞制备和电转化 | 第58-59页 |
| ·Cre重组酶的诱导表达和Kan.丢失菌株的筛选 | 第59页 |
| 2 结果与分析 | 第59-67页 |
| ·酵母基因组的提取 | 第59页 |
| ·酵母染色体第一个GAL1基因敲除 | 第59-63页 |
| ·GAL1基因敲除和重组子的鉴定 | 第60-62页 |
| ·KanMX抗性表达盒的删除 | 第62-63页 |
| ·酵母染色体上双GAL4基因构建 | 第63-65页 |
| ·构建模板质粒PMD18-TGK | 第63页 |
| ·双GAL4基因构建和重组子的鉴定 | 第63-64页 |
| ·KanMX抗性表达盒的删除 | 第64-65页 |
| ·酵母染色体第二个GAL1基因的敲除 | 第65-66页 |
| ·酵母染色体第三个GAL1基因的敲除 | 第66-67页 |
| 3 讨论 | 第67-69页 |
| 4 小结 | 第69-70页 |
| 第三章 重组GAL菌株的生长和发酵性能以及遗传稳定性 | 第70-79页 |
| 1 材料与方法 | 第70-72页 |
| ·材料、主要试剂及仪器设备 | 第70-71页 |
| ·菌株和质粒 | 第70页 |
| ·培养基 | 第70页 |
| ·主要试剂 | 第70页 |
| ·主要仪器和设备 | 第70-71页 |
| ·实验方法 | 第71-72页 |
| ·重组菌的传代培养 | 第71页 |
| ·不同GAL基因型遗传稳定性鉴定 | 第71页 |
| ·重组菌G418和Zeocin抗性丢失的遗传稳定性鉴定 | 第71页 |
| ·葡萄糖培养基中的生长性能试验 | 第71页 |
| ·甘油培养基中的生长性能试验 | 第71-72页 |
| ·半乳糖培养基中的生长性能试验 | 第72页 |
| ·HPLC测定半乳糖含量 | 第72页 |
| ·热致死温度试验 | 第72页 |
| 2 结果与分析 | 第72-77页 |
| ·重组菌株的GAL基因型遗传稳定性 | 第72页 |
| ·重组菌株的抗性丢失遗传稳定性 | 第72-73页 |
| ·重组菌株在葡萄糖培养基中的生长性能 | 第73页 |
| ·不同的诱导模式对重组菌株生长性能以及半乳糖利用的影响 | 第73-77页 |
| ·半乳糖标准曲线 | 第74-75页 |
| ·不同的诱导模式下重组菌株的生长性能和半乳糖含量的变化 | 第75-77页 |
| ·重组菌株的热致死温度 | 第77页 |
| 3 讨论 | 第77-78页 |
| 4 小结 | 第78-79页 |
| 第四章 构建以α-半乳糖苷酶为食品级筛选标记的克隆载体 | 第79-91页 |
| 1 材料与方法 | 第79-83页 |
| ·材料、主要试剂及仪器设备 | 第79-80页 |
| ·菌株和质粒 | 第79页 |
| ·培养基 | 第79-80页 |
| ·主要试剂 | 第80页 |
| ·主要仪器和设备 | 第80页 |
| ·实验方法 | 第80-83页 |
| ·引物设计和PCR扩增 | 第80-81页 |
| ·质粒的提取、酶切和连接 | 第81页 |
| ·片段和T载体的连接 | 第81页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第81-82页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备和转化 | 第82页 |
| ·酿酒酵母感受态细胞制备和电转化 | 第82页 |
| ·α-半乳糖苷酶表达的平板鉴定 | 第82页 |
| ·α-半乳糖苷酶活性测定 | 第82-83页 |
| ·重组菌株的生长性能测定 | 第83页 |
| 2 结果与分析 | 第83-89页 |
| ·产α-半乳糖苷酶的酵母菌株筛选 | 第83页 |
| ·食品级克隆载体的构建 | 第83-85页 |
| ·质粒YEPlac 181的提取 | 第83-84页 |
| ·PGKI启动子的扩增 | 第84页 |
| ·α-半乳糖苷酶基因的扩增 | 第84-85页 |
| ·克隆载体YPM的构建 | 第85页 |
| ·重组质粒的转化和α-半乳糖苷酶表达的平板鉴定 | 第85-86页 |
| ·α-半乳糖苷酶的活性测定 | 第86-88页 |
| ·对硝基酚标准曲线 | 第86-87页 |
| ·α-半乳糖甘酶酶活测定 | 第87-88页 |
| ·重组菌株的生长性能 | 第88-89页 |
| 3 讨论 | 第89-90页 |
| 4 小结 | 第90-91页 |
| 第五章 食品级酿酒酵母高效分泌表达系统构建 | 第91-105页 |
| 1 材料与方法 | 第91-97页 |
| ·材料、主要试剂及仪器设备 | 第91-93页 |
| ·菌株和质粒 | 第91-92页 |
| ·培养基 | 第92页 |
| ·主要试剂 | 第92页 |
| ·主要仪器和设备 | 第92-93页 |
| ·实验方法 | 第93-97页 |
| ·引物设计和PCR扩增 | 第93页 |
| ·质粒的提取、酶切和连接 | 第93页 |
| ·片段和T载体的连接 | 第93-94页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备和转化 | 第94页 |
| ·DNA乙醇沉淀 | 第94页 |
| ·枯草芽孢杆菌基因组提取 | 第94-95页 |
| ·酿酒酵母感受态细胞快速制备和电转化 | 第95页 |
| ·酿酒酵母阳性转化子的筛选 | 第95-96页 |
| ·p-1,3-1,4-葡聚糖酶的诱导分泌表达 | 第96页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性测定 | 第96页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质研究 | 第96-97页 |
| 2 结果与分析 | 第97-103页 |
| ·枯草芽孢杆菌基因组的提取 | 第97页 |
| ·片段的扩增 | 第97-99页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的扩增 | 第97-98页 |
| ·GAL1启动子基因的扩增 | 第98页 |
| ·MFal信号肽基因的扩增 | 第98-99页 |
| ·ADH1终止子基因的扩增 | 第99页 |
| ·表达载体YGMPA-PM的构建 | 第99-100页 |
| ·构建载体YGM | 第99页 |
| ·构建载体YGMPA | 第99-100页 |
| ·表达载体YGMPA-PM的构建 | 第100页 |
| ·重组载体YGMPA-PM的转化和重组子鉴定 | 第100-101页 |
| ·p-1,3-1,4-葡聚糖酶在不同GAL菌株中的表达 | 第101-102页 |
| ·β-葡聚糖标准曲线 | 第101页 |
| ·不同GAL菌株β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达 | 第101-102页 |
| ·重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质 | 第102-103页 |
| ·最适pH | 第102页 |
| ·pH稳定性 | 第102-103页 |
| ·最适反应温度 | 第103页 |
| ·热稳定性 | 第103页 |
| 3 讨论 | 第103-104页 |
| 4 小结 | 第104-105页 |
| 第六章 食品级酿酒酵母高效展示表达系统构建 | 第105-117页 |
| 1 材料与方法 | 第105-109页 |
| ·材料、主要试剂及仪器设备 | 第105-107页 |
| ·菌株和质粒 | 第105页 |
| ·培养基 | 第105-106页 |
| ·主要试剂 | 第106页 |
| ·主要仪器和设备 | 第106-107页 |
| ·实验方法 | 第107-109页 |
| ·引物设计和PCR扩增 | 第107页 |
| ·质粒的提取、酶切和连接 | 第107页 |
| ·片段和T载体的连接 | 第107页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备和转化 | 第107-108页 |
| ·DNA乙醇沉淀 | 第108页 |
| ·酿酒酵母感受态细胞快速制备和电转化 | 第108页 |
| ·酿酒酵母转化子的筛选 | 第108-109页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶展示表达的诱导条件 | 第109页 |
| ·展示表达p-],3-1,4-葡聚糖酶的酵母细胞收集 | 第109页 |
| ·展示表达的p-1,3-1,4-葡聚糖酶活性测定 | 第109页 |
| ·展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质测定 | 第109页 |
| 2 结果与分析 | 第109-114页 |
| ·表达载体YGMPNA-PM的构建 | 第110-111页 |
| ·凝集素基因片段的扩增 | 第110页 |
| ·片段PN的连接 | 第110页 |
| ·展示表达载体YGMPNA-PM的构建 | 第110-111页 |
| ·重组质粒的转化和重组子的平板鉴定 | 第111页 |
| ·p-1,3-1,4-葡聚糖酶的定位 | 第111-112页 |
| ·不同GAL菌株对p-1,3-1,4-葡聚糖酶展示表达的影响 | 第112-113页 |
| ·展示表达的β-l,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质 | 第113-114页 |
| ·最适反应温度 | 第113页 |
| ·热稳定性 | 第113-114页 |
| ·最适pH | 第114页 |
| ·pH稳定性 | 第114页 |
| 3 讨论 | 第114-115页 |
| 4 小结 | 第115-117页 |
| 第七章 结论和展望 | 第117-120页 |
| 1 结论 | 第117-118页 |
| 2 展望 | 第118-120页 |
| 参考文献 | 第120-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
| 附录 | 第134-140页 |
| 附:个人简历及攻读博士学位期间发表的论文 | 第140页 |
