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人源PI3KC3复合物结构及其膜结合特征的研究

摘要第3-4页
abstract第4-5页
主要英文缩略词对照表第9-10页
第1章 引言第10-37页
    1.1 细胞自噬简介第10-13页
        1.1.1 细胞自噬定义及其研究历史概述第10页
        1.1.2 细胞自噬分类第10-11页
        1.1.3 细胞自噬的过程第11-13页
    1.2 细胞自噬的核心蛋白机器第13-19页
        1.2.1 ATG1/ULK1复合物第13-14页
        1.2.2 PI3KC3复合物第14-16页
        1.2.3 PI3P效应蛋白:ATG2-ATG18/WIPI复合物第16-17页
        1.2.4 ATG9膜蛋白第17-18页
        1.2.5 两个类泛素化系统第18-19页
    1.3 磷酸肌醇在细胞自噬中的作用第19-22页
        1.3.1 PI3P第19-20页
        1.3.2 PI5P和PI(3,5)P2第20-21页
        1.3.3 PI4P和PI(4,5)P2第21页
        1.3.4 PI(3,4)P2和PI(3,4,5)P3第21-22页
    1.4 PI3K复合物的结构研究概述第22-31页
        1.4.1 酵母PI3K复合物的结构研究现状第22-26页
        1.4.2 哺乳动物PI3KC3复合物的结构研究现状第26-31页
    1.5 冷冻电镜重构单颗粒技术的原理和流程第31-36页
        1.5.1 电子显微镜简介第31-33页
        1.5.2 电镜单颗粒重构技术的原理第33-34页
        1.5.3 限制冷冻电镜单颗粒技术分辨率的因素第34页
        1.5.4 冷冻电镜单颗粒技术的基本流程第34-36页
    1.6 本研究目的和意义第36-37页
第2章 实验材料与方法第37-67页
    2.1 实验材料第37-52页
        2.1.1 载体第37-38页
        2.1.2 引物第38-41页
        2.1.3 菌株和细胞第41-42页
        2.1.4 试剂和抗体第42-43页
        2.1.5 自备培养基和缓冲液的配制第43-49页
        2.1.6 仪器与耗材第49-52页
    2.2 实验方法第52-67页
        2.2.1 载体构建第52-60页
        2.2.2 蛋白表达纯化第60-62页
        2.2.3 PI3K激酶活性实验第62-63页
        2.2.4 脂质体漂浮实验第63-64页
        2.2.5 蛋白免疫印迹第64-65页
        2.2.6 内质网提取第65页
        2.2.7 内质网与蛋白结合实验第65页
        2.2.8 电镜相关实验第65-67页
第3章 人源PI3KC3复合物的表达纯化分析第67-76页
    3.1 引言第67页
    3.2 实验结果第67-75页
        3.2.1 大肠杆菌等表达系统中无法得到完整的人源PI3KC3复合物第67-68页
        3.2.2 HEK293细胞中纯化得到性质较好且完整的人源PI3KC3复合物第68-74页
        3.2.3 从HEK293细胞提纯的人源PI3KC3复合物具有酶活性第74-75页
        3.2.4 人源PI3KC3复合物有多个未报道的磷酸化修饰位点,功能未知第75页
    3.3 本章小结第75-76页
第4章 人源PI3KC3-C1和C2复合物的冷冻电镜结构第76-87页
    4.1 引言第76页
    4.2 结果第76-86页
        4.2.1 人源PI3KC3-C1和C2复合物的负染电镜分析第76-81页
        4.2.2 人源PI3KC3-C1和C2复合物的冷冻电镜三维重构第81-84页
        4.2.3 人源PI3KC3-C1和C2复合物原子模型的建立第84-85页
        4.2.5 人源PI3KC3-C1和C2复合物结构的比较第85-86页
    4.3 本章小结第86-87页
第5章 人源PI3KC3-C1复合物在膜上呈“站立”构象第87-95页
    5.1 引言第87页
    5.2 实验结果第87-94页
        5.2.1 人源PI3KC3-C1复合物能够结合PI3P和PI第87-89页
        5.2.2 ATG14LC末端的BATs结构域决定人源PI3KC3-C1的膜结合活性第89-91页
        5.2.3 VPS34CTD决定人源PI3KC3-C1复合物在膜上采取“站立”的构象第91-94页
    5.3 本章小结第94-95页
第6章 人源PI3KC3-C1和C2复合物具有不同的膜结合活性第95-100页
    6.1 引言第95页
    6.2 实验结果第95-99页
        6.2.1 人源PI3KC3-C1比C2复合物具有更强的PI3P结合能力第95-96页
        6.2.2 人源PI3KC3-C1比C2复合物具有更强的PI结合能力第96-98页
        6.2.3 人源PI3KC3-C1比C2复合物具有更强的内质网结合能力第98-99页
    6.3 本章小结第99-100页
第7章 人源PI3KC3-C1体外形成cluster第100-111页
    7.1 引言第100页
    7.2 实验结果第100-110页
        7.2.1 人源PI3KC3-C1复合物与磷脂作用形成无规则cluster第100-105页
        7.2.2 人源PI3KC3-C1复合物cluster的形成依赖于VPS34的激酶活性第105-108页
        7.2.3 人源PI3KC3-C1复合物cluster的形成依赖于其膜结合活性第108-110页
    7.3 本章小结第110-111页
第8章 讨论与展望第111-116页
    8.1 本文总结第111-112页
    8.2 讨论与展望第112-116页
        8.2.1 人源PI3KC3蛋白复合物的表达纯化和结构解析第112-114页
        8.2.2 人源PI3KC3-C1和C2复合物结构的比较第114页
        8.2.3 人源PI3KC3-C1和C2复合物在膜上的取向第114-115页
        8.2.4 人源PI3KC3-C1复合物与膜成分形成的cluster与欧米茄体关系第115-116页
参考文献第116-128页
致谢第128-131页
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果第131页

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