| 摘要 | 第7-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 主要符号对照表 | 第17-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-34页 |
| 1.1.脂解及脂解酶的类型 | 第18-19页 |
| 1.2.胞内脂解途径相关脂酶及其调控机制 | 第19-30页 |
| 1.2.1 中性脂肪酶介导的脂解 | 第19-26页 |
| 1.2.2 自噬和酸性脂肪酶介导的脂解 | 第26-29页 |
| 1.2.3 其他脂酶 | 第29-30页 |
| 1.3 脂解代谢产物的分子信号作用 | 第30-32页 |
| 1.3.1 脂解产生的脂肪酸与PPAR信号 | 第30-31页 |
| 1.3.2 脂解产生的脂肪酸与胰岛素信号 | 第31-32页 |
| 1.3.3 脂解产生的DG与PKC信号 | 第32页 |
| 1.4 胞内脂酶在鱼类中的研究 | 第32-33页 |
| 1.5 本研究的目标、意义和内容 | 第33-34页 |
| 第二章 草鱼中性脂酶的克隆及其在脂肪细胞营养限制过程中的表达 | 第34-48页 |
| 2.1 材料与方法 | 第34-39页 |
| 2.1.1 主要试验仪器和试剂 | 第34-35页 |
| 2.1.2 草鱼前体脂肪细胞的分离培养及处理： | 第35页 |
| 2.1.3 中性脂酶基因完整CDS的获得 | 第35-37页 |
| 2.1.3.1 第一链c DNA的合成 | 第35-36页 |
| 2.1.3.2 引物设计 | 第36页 |
| 2.1.3.3 PCR扩增 | 第36-37页 |
| 2.1.3.4 PCR产物纯化回收 | 第37页 |
| 2.1.3.5 DNA纯化产物连接T载体 | 第37页 |
| 2.1.3.6 重组质粒转化感受态细胞以及挑选阳性克隆测序 | 第37页 |
| 2.1.4 脂酶序列的生物信息学分析 | 第37页 |
| 2.1.5 甘油三酯含量检测 | 第37页 |
| 2.1.6 脂肪细胞脂滴及细胞核染色 | 第37-38页 |
| 2.1.7 Real-time PCR | 第38页 |
| 2.1.8 Western Blot | 第38页 |
| 2.1.9 统计分析 | 第38-39页 |
| 2.2 结果与分析 | 第39-44页 |
| 2.2.1 中性脂酶CDS序列分析 | 第39页 |
| 2.2.2 基因结构分析 | 第39-40页 |
| 2.2.3 共线性分析 | 第40-41页 |
| 2.2.4 中性脂酶在草鱼中的组织表达 | 第41页 |
| 2.2.5 营养限制促进ATGL的表达 | 第41-44页 |
| 2.3 讨论 | 第44-47页 |
| 2.4 小结 | 第47-48页 |
| 第三章 草鱼脂肪细胞ATGL的功能研究 | 第48-61页 |
| 3.1 材料与方法 | 第48-51页 |
| 3.1.1 主要仪器 | 第48页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第48页 |
| 3.1.3 原核表达载体的构建 | 第48-49页 |
| 3.1.4 GB1-6*His-PET-21a(+)-ATGL重组蛋白的诱导表达 | 第49页 |
| 3.1.5 pET-21a-PEDF重组蛋白的亲和纯化 | 第49页 |
| 3.1.6 草鱼前体脂肪细胞的培养 | 第49页 |
| 3.1.7 甘油三酯含量测定 | 第49页 |
| 3.1.8 游离脂肪酸含量的测定 | 第49页 |
| 3.1.9 甘油含量的测定 | 第49-50页 |
| 3.1.10 Gyk酶活检测 | 第50页 |
| 3.1.11 实时定量PCR(RT-PCR) | 第50页 |
| 3.1.12 脂肪细胞免疫荧光 | 第50-51页 |
| 3.1.13 脂肪细胞脂滴及细胞核染色 | 第51页 |
| 3.1.14 数据分析 | 第51页 |
| 3.2 结果与分析 | 第51-56页 |
| 3.2.1 ATGL重组蛋白的诱导表达及条件优化 | 第51-53页 |
| 3.2.2 目的蛋白的亲和纯化 | 第53页 |
| 3.2.3 脂肪细胞对融合蛋白的吸收 | 第53页 |
| 3.2.4 ATGL在草鱼脂肪细胞中的定位 | 第53-54页 |
| 3.2.5 草鱼ATGL促进脂肪细胞甘油三酯的分解 | 第54页 |
| 3.2.6 草鱼ATGL促进脂肪细胞脂肪酸β-氧化基因及重新酯化基因的表达 | 第54-55页 |
| 3.2.7 ATGL-PPARγ防止脂肪细胞内质网应激的发生及甘油三酯的过度丢失 | 第55-56页 |
| 3.3 讨论 | 第56-60页 |
| 3.4 小结 | 第60-61页 |
| 第四章 营养限制条件下ATGL转录调控机制的研究 | 第61-76页 |
| 4.1 材料与方法 | 第61-66页 |
| 4.1.1 主要仪器 | 第61页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第61页 |
| 4.1.3 Genome walking | 第61-62页 |
| 4.1.4 草鱼ATGL基因5’侧翼区系列缺失体的构建 | 第62-63页 |
| 4.1.5 生物信息学分析 | 第63页 |
| 4.1.6 转录因子结合位点的缺失突变 | 第63-64页 |
| 4.1.7 转录因子PPARα、CREB及 RXRα过表达载体的构建 | 第64-65页 |
| 4.1.8 细胞转染 | 第65页 |
| 4.1.9 萤光素酶活性检测 | 第65页 |
| 4.1.10 草鱼原代脂肪细胞培养 | 第65-66页 |
| 4.1.11 甘油三酯含量测定 | 第66页 |
| 4.1.12 脂肪细胞脂滴及细胞核染色 | 第66页 |
| 4.1.13 实时定量PCR(RT-PCR) | 第66页 |
| 4.1.14 Western Blot | 第66页 |
| 4.1.15 cAMP含量测定 | 第66页 |
| 4.1.16 PKA酶活测定 | 第66页 |
| 4.1.17 数据分析 | 第66页 |
| 4.2 结果与分析 | 第66-73页 |
| 4.2.1 草鱼ATGL基因5’侧翼区系列报告基因质粒的构建 | 第66-67页 |
| 4.2.2 草鱼ATGL基因核心启动子的鉴定 | 第67-68页 |
| 4.2.3 草鱼ATGL基因核心启动子序列转录因子结合位点预测 | 第68页 |
| 4.2.4 PPARα和CREB位点是维持草鱼ATGL基因启动子活性的顺式作用元件 | 第68-69页 |
| 4.2.5 cAMP/PKA/CREB调控刺激状态下ATGL的转录 | 第69-72页 |
| 4.2.6 PPARα调控基础状态下ATGL的转录 | 第72页 |
| 4.2.7 营养限制条件下cAMP/PKA/CREB参与ATGL的转录调控 | 第72-73页 |
| 4.3 讨论 | 第73-75页 |
| 4.4 小结 | 第75-76页 |
| 第五章 营养限制条件下CAMP/PKA-ATGL信号通路维持草鱼脂肪细胞脂质稳态的机制研究 | 第76-84页 |
| 5.1 材料与方法 | 第76-78页 |
| 5.1.1 主要仪器 | 第76页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第76页 |
| 5.1.3 草鱼原代脂肪细胞培养及饥饿处理 | 第76-77页 |
| 5.1.4 草鱼的饲养及在体饥饿 | 第77页 |
| 5.1.5 组织学观察 | 第77页 |
| 5.1.6 cAMP含量测定 | 第77页 |
| 5.1.7 PKA酶活测定 | 第77页 |
| 5.1.8 甘油三酯含量测定 | 第77页 |
| 5.1.9 游离脂肪酸含量的测定 | 第77页 |
| 5.1.10 甘油含量的测定 | 第77-78页 |
| 5.1.11 脂肪细胞脂滴及细胞核染色 | 第78页 |
| 5.1.12 实时定量PCR(RT-PCR) | 第78页 |
| 5.1.13 数据分析 | 第78页 |
| 5.2 结果与分析 | 第78-81页 |
| 5.2.1 PPARγ抑制饥饿过程中内质网应激的产生及防止长期饥饿时TG的过度丢失 | 第78-81页 |
| 5.2.2 长期在体营养限制激活ATGL介导的脂解和PPARγ介导的脂肪酸重新酯化 | 第81页 |
| 5.3 讨论 | 第81-83页 |
| 5.4 小结 | 第83-84页 |
| 第六章 本研究主要结论、创新点与下一步研究内容 | 第84-87页 |
| 6.1 结论 | 第84页 |
| 6.2 创新点 | 第84-86页 |
| 6.3 下一步研究内容 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-99页 |
| 附录 | 第99-103页 |
| 致谢 | 第103-105页 |
| 作者简介 | 第105-107页 |
