| 致谢 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第13-34页 |
| 1.1 酯酶概述 | 第13页 |
| 1.2 酯酶主要来源 | 第13页 |
| 1.3 酯酶的应用及前景 | 第13-15页 |
| 1.3.1 农业方面的应用 | 第13-14页 |
| 1.3.2 医药工业方面的应用 | 第14页 |
| 1.3.3 在食品工业的应用 | 第14页 |
| 1.3.4 酯酶在化学化工中的应用 | 第14-15页 |
| 1.3.5 酯酶在环保行业中的应用 | 第15页 |
| 1.4 酯酶的异源表达 | 第15-16页 |
| 1.4.1 大肠杆菌表达系统 | 第15页 |
| 1.4.2 枯草芽孢杆菌表达系统 | 第15-16页 |
| 1.4.3 信号肽影响蛋白异源表达 | 第16页 |
| 1.5 蛋白质工程概述 | 第16-25页 |
| 1.5.1 蛋白质工程理性设计 | 第18-19页 |
| 1.5.2 蛋白质工程半理性设计 | 第19-20页 |
| 1.5.3 蛋白质定向进化 | 第20-25页 |
| 1.5.3.1 随机突变 | 第22-23页 |
| 1.5.3.2 同源依赖型重组 | 第23-24页 |
| 1.5.3.3 非同源依赖性重组 | 第24页 |
| 1.5.3.4 蛋白质循环置换 | 第24-25页 |
| 1.6 酶的固定化 | 第25-33页 |
| 1.6.1 传统的酶固定化方法 | 第25-27页 |
| 1.6.1.1 吸附法 | 第26页 |
| 1.6.1.2 包埋法 | 第26-27页 |
| 1.6.1.3 交联法 | 第27页 |
| 1.6.1.4 共价结合法 | 第27页 |
| 1.6.2 酶的纳米级固定化 | 第27-33页 |
| 1.6.2.1 纳米颗粒 | 第27-29页 |
| 1.6.2.2 纳米管 | 第29页 |
| 1.6.2.3 纳米纤维 | 第29-30页 |
| 1.6.2.4 纳米纤维膜 | 第30页 |
| 1.6.2.5 新型有机-无机纳米花固定化 | 第30-33页 |
| 1.6.2.5.1 不同金属离子与蛋白质合成杂化纳米花 | 第30-31页 |
| 1.6.2.5.2 不同生物分子合成杂合纳米花 | 第31-32页 |
| 1.6.2.5.3 多酶组合纳米花 | 第32页 |
| 1.6.2.5.4 有机无机纳米花的应用价值 | 第32-33页 |
| 1.7 本研究的目的和意义 | 第33-34页 |
| 第二章 产酯酶海洋菌的筛选与鉴定 | 第34-39页 |
| 2.1 引言 | 第34页 |
| 2.2 材料和方法 | 第34-37页 |
| 2.2.1 材料 | 第34-35页 |
| 2.2.1.1 样品 | 第34页 |
| 2.2.1.2 试剂 | 第34页 |
| 2.2.1.3 培养基 | 第34页 |
| 2.2.1.4 相关溶液 | 第34页 |
| 2.2.1.5 PCR引物 | 第34-35页 |
| 2.2.1.6 仪器设备 | 第35页 |
| 2.2.2 实验方法 | 第35-37页 |
| 2.2.2.1 酯酶的初筛 | 第35-36页 |
| 2.2.2.2 酯酶的复筛 | 第36页 |
| 2.2.2.3 细菌基因组DNA抽提 | 第36页 |
| 2.2.2.4 细菌16SrRNA分子鉴定 | 第36-37页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第37-38页 |
| 2.3.1 筛选结果 | 第37页 |
| 2.3.2 菌株分子鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3.3 讨论 | 第38页 |
| 2.4 小结 | 第38-39页 |
| 第三章 阴沟肠杆菌酯酶的克隆表达与纯化 | 第39-50页 |
| 3.1 引言 | 第39页 |
| 3.2 材料和方法 | 第39-44页 |
| 3.2.1 材料 | 第39-41页 |
| 3.2.1.1 菌株和质粒 | 第39-40页 |
| 3.2.1.2 试剂 | 第40页 |
| 3.2.1.3 培养基 | 第40页 |
| 3.2.1.4 溶液 | 第40页 |
| 3.2.1.5 引物 | 第40页 |
| 3.2.1.6 仪器设备 | 第40-41页 |
| 3.2.2 方法 | 第41-44页 |
| 3.2.2.1 PCR扩增Lip基因 | 第41-42页 |
| 3.2.2.2 PCR产物纯化、回收和酶切 | 第42页 |
| 3.2.2.3 构建pGEX-6p-Lip重组质粒 | 第42页 |
| 3.2.2.4 酶连产物电转化 | 第42-43页 |
| 3.2.2.5 Lip的表达与纯化 | 第43-44页 |
| 3.2.2.6 酯酶三级结构模拟和分析 | 第44页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第44-49页 |
| 3.3.1 Lip基因的克隆 | 第44页 |
| 3.3.2 酯酶基因Lip序列分析及进化分析 | 第44-46页 |
| 3.3.3 Lip的表达与纯化 | 第46-47页 |
| 3.3.4 酯酶Lip同源建模和分子对接 | 第47-49页 |
| 3.4 小结 | 第49-50页 |
| 第四章 Lip的酶学性质及体外定向进化 | 第50-62页 |
| 4.1 引言 | 第50页 |
| 4.2 材料与方法 | 第50-55页 |
| 4.2.1 材料 | 第50-53页 |
| 4.2.1.1 菌株和质粒 | 第50-51页 |
| 4.2.1.2 试剂 | 第51页 |
| 4.2.1.3 培养基 | 第51页 |
| 4.2.1.4 溶液 | 第51-52页 |
| 4.2.1.5 引物 | 第52页 |
| 4.2.1.6 仪器与设备 | 第52-53页 |
| 4.2.2 方法 | 第53-55页 |
| 4.2.2.1 易错PCR突变文库的构建 | 第53-54页 |
| 4.2.2.2 定点突变 | 第54-55页 |
| 4.2.2.3 点饱和突变 | 第55页 |
| 4.2.2.4 基于96孔板的高通量突变文库筛选 | 第55页 |
| 4.2.2.5 酯酶动力学参数测定 | 第55页 |
| 4.2.2.6 酯酶三级结构模拟和分析 | 第55页 |
| 4.3 结果与分析 | 第55-61页 |
| 4.3.1 易错PCR构建突变库 | 第55-56页 |
| 4.3.2 定点突变 | 第56-58页 |
| 4.3.3 点饱和突变 | 第58-61页 |
| 4.4 小结 | 第61-62页 |
| 第五章 野生型及突变型酯酶酶学性质分析 | 第62-74页 |
| 5.1 前言 | 第62页 |
| 5.2 材料与方法 | 第62-66页 |
| 5.2.1 材料 | 第62-64页 |
| 5.2.1.1 菌株和质粒 | 第62页 |
| 5.2.1.2 试剂 | 第62-63页 |
| 5.2.1.3 培养基 | 第63页 |
| 5.2.1.4 溶液 | 第63页 |
| 5.2.1.5 仪器与设备 | 第63-64页 |
| 5.2.2 方法 | 第64-66页 |
| 5.2.2.1 蛋白浓度测定 | 第64-65页 |
| 5.2.2.2 对硝基苯酚标准曲线绘制 | 第65页 |
| 5.2.2.3 酯酶酶活测定方法 | 第65页 |
| 5.2.2.4 酯酶最适温度和最适pH测定方法 | 第65-66页 |
| 5.2.2.5 酯酶热稳定性和pH稳定性测定方法 | 第66页 |
| 5.2.2.6 金属离子和化学试剂对酯酶酶活影响的测定方法 | 第66页 |
| 5.2.2.7 酯酶底物特异性测定 | 第66页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第66-72页 |
| 5.3.1 对硝基苯酚标准曲线 | 第66-67页 |
| 5.3.2 Lip和Y193G的底物特异性分析 | 第67-68页 |
| 5.3.3 酶促反映的最适温度与酶的热稳定性分析 | 第68-70页 |
| 5.3.4 酶促反应的最适反应pH和pH耐受分析 | 第70页 |
| 5.3.5 金属离子、有机溶剂及去污剂对酯酶的影响 | 第70-72页 |
| 5.4 小结 | 第72-74页 |
| 第六章 酯酶-无机盐杂化纳米花固定化 | 第74-85页 |
| 6.1 引言 | 第74页 |
| 6.2 材料和方法 | 第74-75页 |
| 6.2.1 材料 | 第74-75页 |
| 6.2.1.1 样品 | 第74页 |
| 6.2.1.2 试剂 | 第74页 |
| 6.2.1.3 培养基 | 第74页 |
| 6.2.1.4 溶液 | 第74-75页 |
| 6.2.1.5 仪器设备 | 第75页 |
| 6.3 方法 | 第75-77页 |
| 6.3.1 Y193C-Fe_3(PO_4)_2杂化纳米花酶浓度优化 | 第75页 |
| 6.3.2 Y193C-Fe_3(PO_4)_2杂化纳米花硫酸亚铁添加量优化 | 第75-76页 |
| 6.3.3 Y193C-Fe_3(PO_4)_2杂化纳米花包埋率及重复利用分析 | 第76页 |
| 6.3.4 扫描电镜分析(SEM) | 第76页 |
| 6.3.5 透射电镜分析(TEM) | 第76页 |
| 6.3.6 红外分析(FT-IR) | 第76页 |
| 6.3.7 酶活的测定方法 | 第76页 |
| 6.3.8 固定化酶最适温度和最适pH测定 | 第76页 |
| 6.3.9 固定化酶热稳定和pH耐受测定 | 第76-77页 |
| 6.3.10 固定化酶动力学常数测定 | 第77页 |
| 6.3.11 固定化酶合成乙酸香叶酯 | 第77页 |
| 6.3.12 GC-MS分析方法 | 第77页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第77-83页 |
| 6.4.1 酶浓度对包埋率和纳米花形态的影响 | 第77-78页 |
| 6.4.2 无机盐浓度对包埋率和纳米花形态的影响 | 第78-80页 |
| 6.4.3 透射电镜分析 | 第80页 |
| 6.4.4 Y193C-Fe_3(PO_4)_2杂化纳米花固定化效率 | 第80页 |
| 6.4.5 Y193C-Fe_3(PO_4)_2杂化纳米花FT-IR分析 | 第80-81页 |
| 6.4.6 固定化酶的最适反应温度和热稳定性 | 第81-82页 |
| 6.4.7 固定化酶的最适反应pH和pH稳定性 | 第82页 |
| 6.4.8 动力学常数 | 第82页 |
| 6.4.9 固定化后酶的重复使用 | 第82-83页 |
| 6.4.10 固定化酶用于乙酸香叶酯的合成 | 第83页 |
| 6.5 小结 | 第83-85页 |
| 第七章 结论和展望 | 第85-87页 |
| 7.1 结论 | 第85-86页 |
| 7.2 特色和创新 | 第86页 |
| 7.3 展望 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-98页 |
| 附录 | 第98-99页 |
