| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 缩略词表(ABBREVIATIONS) | 第12-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-19页 |
| 1.1 鸡毒支原体 | 第13-14页 |
| 1.1.1 鸡毒支原体的特征及感染过程 | 第13-14页 |
| 1.1.2 鸡毒支原体的危害及防治 | 第14页 |
| 1.2 miRNAs在MG感染中的作用 | 第14-15页 |
| 1.3 miR-130b-3p在疾病中的研究进展 | 第15-16页 |
| 1.4 PTEN/PI3K/AKT通路在疾病中的研究进展 | 第16-18页 |
| 1.5 目的和意义 | 第18-19页 |
| 2 实验材料和方法 | 第19-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第19-23页 |
| 2.1.1 主要试剂及溶液的配制 | 第19-21页 |
| 2.1.1.1 主要生化试剂及分子生物学材料 | 第19-20页 |
| 2.1.1.2 主要溶液的配制 | 第20-21页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第21-22页 |
| 2.1.3 生物信息学分析相关软件及数据库 | 第22-23页 |
| 2.2 方法 | 第23-44页 |
| 2.2.1 MG-HS的培养及活力检测 | 第23页 |
| 2.2.1.1 MG-HS的复苏及扩大培养 | 第23页 |
| 2.2.1.2 颜色变化单位检测MG-HS的活力 | 第23页 |
| 2.2.2 靶基因的预测与分析 | 第23-24页 |
| 2.2.3 PTEN3’UTR双荧光素酶报告基因载体的构建 | 第24-30页 |
| 2.2.3.1 PTEN3’UTR的扩增与回收 | 第24-25页 |
| 2.2.3.2 pisCHECKTM-2载体片段的获取 | 第25-26页 |
| 2.2.3.3 PTEN3’UTR与psiCHECKTM-2载体的连接及产物测序 | 第26-30页 |
| 2.2.4 双荧光素酶报告基因的检测 | 第30-32页 |
| 2.2.4.1 DF-1细胞的培养 | 第30-31页 |
| 2.2.4.2 脂质体介导的细胞转染 | 第31页 |
| 2.2.4.3 双荧光素酶报告基因的检测 | 第31-32页 |
| 2.2.5 超表达gga-miR-130b-3pDF-1细胞中PTEN表达分析 | 第32-38页 |
| 2.2.5.1 引物设计 | 第32页 |
| 2.2.5.2 脂质体介导的miRNAmimics的细胞转染 | 第32-33页 |
| 2.2.5.3 细胞总RNA的提取及检测 | 第33-34页 |
| 2.2.5.4 cDNA质量检测及目的片段的扩增 | 第34-35页 |
| 2.2.5.6 PTENmRNA的相对表达量检测 | 第35-38页 |
| 2.2.6 抑制gga-miR-130b-3pDF-1细胞中PTEN表达分析 | 第38页 |
| 2.2.6.1 gga-miR-130b-3p抑制效果的检测 | 第38页 |
| 2.2.6.2 PTENmRNA及蛋白水平的表达量检测 | 第38页 |
| 2.2.7 gga-miR-130b-3p及PTEN在不同时期MG-HS感染SPF鸡胚肺组织中的表达分析 | 第38-41页 |
| 2.2.7.1 鸡胚肺组织总RNA的提取与质量检测 | 第38-39页 |
| 2.2.7.2 cDNA第一链的合成 | 第39-40页 |
| 2.2.7.3 cDNA质量检测及目的片段的扩增 | 第40页 |
| 2.2.7.4 qPCR检测鸡胚肺组织中gga-miR-130b-3p的相对表达量 | 第40-41页 |
| 2.2.7.5 PTENmRNA的相对表达量检测 | 第41页 |
| 2.2.8 gga-miR-130b-3p及PTEN在MG-HS感染的DF-1细胞中的表达分析 | 第41-42页 |
| 2.2.8.1 DF-1细胞的攻毒 | 第41页 |
| 2.2.8.2 细胞总RNA的提取及cDNA第一条链的合成 | 第41-42页 |
| 2.2.9 超表达gga-miR-130b-3p的DF-1细胞中PI3K、AKT及NF-κB表达分析 | 第42页 |
| 2.2.9.1 引物设计 | 第42页 |
| 2.2.9.2 PI3K、AKT及NF-κBmRNA水平表达分析 | 第42页 |
| 2.2.10 抑制gga-miR-130b-3p的DF-1细胞中PI3K、AKT及NF-κB表达分析 | 第42页 |
| 2.2.11 gga-miR-130b-3p对细胞增殖及细胞周期的影响 | 第42-44页 |
| 2.2.11.1 CCK-8检测细胞增殖 | 第42-43页 |
| 2.2.11.2 细胞周期分析 | 第43-44页 |
| 3 实验结果 | 第44-58页 |
| 3.1 gga-miR-130b-3p的靶基因预测及分析 | 第44-46页 |
| 3.2 PTEN3’UTR双荧光素酶报告基因载体的构建 | 第46-47页 |
| 3.2.1 PTEN3’UTR序列的扩增 | 第46页 |
| 3.2.2 psiCHECKTM-2-PTEN3’UTR重组质粒的鉴定 | 第46-47页 |
| 3.2.3 psiCHECKTM-2-PTEN3’UTR重组质粒的测序 | 第47页 |
| 3.3 PTEN3’UTR双荧光素酶报告基因的分析 | 第47-48页 |
| 3.4 超表达gga-miR-130b-3p对PTEN基因表达量的影响 | 第48-49页 |
| 3.5 抑制gga-miR-130b-3p对PTEN表达量的影响 | 第49-50页 |
| 3.6 gga-miR-130b-3p及PTEN在鸡胚肺组织中的表达分析 | 第50-53页 |
| 3.6.1 鸡胚肺组织总RNA的提取 | 第50-51页 |
| 3.6.2 鸡胚肺组织cDNA质量分析 | 第51页 |
| 3.6.3 SPF鸡胚肺组织中gga-miR-130b-3p的扩增 | 第51-52页 |
| 3.6.4 SPF鸡胚的肺组织中gga-miR-130b-3p及PTEN的表达分析 | 第52-53页 |
| 3.7 DF-1细胞中gga-miR-130b-3p及PTEN的表达分析 | 第53页 |
| 3.8 细胞中超表达gga-miR-130b-3p对PI3K、AKT及NF-κB表达量的影响 | 第53-54页 |
| 3.9 细胞中抑制gga-miR-130b-3p对PI3K、AKT、NF-κB表达量的影响 | 第54-56页 |
| 3.10 gga-miR-130b-3p对DF-1细胞增殖及周期的影响 | 第56-58页 |
| 4 讨论 | 第58-61页 |
| 5 本研究得到的结果 | 第61页 |
| 6 研究展望 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
