| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-8页 |
| 第一部分 引言 | 第8-15页 |
| ·CTCF介绍 | 第8-11页 |
| ·RNAi介绍 | 第11-15页 |
| 第二部分 siRNA转染载体的构建 | 第15-23页 |
| ·材料 | 第15页 |
| ·质粒、载体、序列 | 第15页 |
| ·工具酶与试剂 | 第15页 |
| ·LB培养基 | 第15页 |
| ·实验仪器 | 第15页 |
| ·方法 | 第15-20页 |
| ·几种敲除CTCF基因mRNA发夹(SiRNA)的设计思路 | 第16-17页 |
| ·几种发夹结构寡核苷酸模板引物的设计结果 | 第17-18页 |
| ·合成的寡核苷酸SiRNA模板进行退火 | 第18页 |
| ·退火后的寡核苷酸siRNA模板与_pSilencer载体连接 | 第18-19页 |
| ·转化大肠杆菌感受态细胞DH5a | 第19页 |
| ·质粒提取、琼脂糖凝胶电泳与测序 | 第19-20页 |
| ·敲除质粒双酶切反应 | 第20页 |
| ·结果 | 第20-22页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第20-22页 |
| ·结果讨论 | 第22-23页 |
| ·质粒提取时需要注意几点 | 第22页 |
| ·敲除质粒双酶切结果分析 | 第22页 |
| ·提取质粒送去测序结果分析 | 第22-23页 |
| 第三部分 稳定转染干扰CTCF基因质粒的细胞系的建立 | 第23-31页 |
| ·材料 | 第23页 |
| ·细胞培养、转染及加压筛选试剂 | 第23页 |
| ·待转染质粒 | 第23页 |
| ·仪器及试剂 | 第23页 |
| ·方法 | 第23-25页 |
| ·G418的最佳筛选浓度的确定 | 第24页 |
| ·稳定转染pEGFP质粒的细胞的筛选 | 第24-25页 |
| ·稳定转染敲除质粒的细胞筛选 | 第25页 |
| ·结果 | 第25-29页 |
| ·G418的最佳筛选浓度的选择 | 第26页 |
| ·稳定转染pEGFP质粒的细胞的获得 | 第26-27页 |
| ·4种敲除质粒转染时阳性对照质粒24小时后的转染效率 | 第27-29页 |
| ·敲除效率阳性对照组实验结果 | 第29页 |
| ·结果讨论 | 第29-31页 |
| ·筛选之前G418浓度的确定 | 第29-30页 |
| ·G418的最佳筛选浓度的确定结果分析 | 第30页 |
| ·转染效率分析 | 第30页 |
| ·敲除效率分析 | 第30-31页 |
| 第四部分 CTCF干扰效率分析 | 第31-55页 |
| ·材料 | 第31-35页 |
| ·试剂 | 第31-34页 |
| ·仪器 | 第34-35页 |
| ·方法 | 第35-43页 |
| ·蛋白免疫印迹对CTCF在敲除和野生型MCF-7细胞中表达量差异性分析 | 第35-39页 |
| ·Real-Time PCR对CTCF在敲除和野生型MCF-7细胞中表达差异性分析 | 第39-43页 |
| ·结果 | 第43-52页 |
| ·BCA法测定蛋白标准曲线结果 | 第43-44页 |
| ·蛋白浓度测定结果 | 第44页 |
| ·蛋白免疫印迹对CTCF在敲除和野生型细胞中表达差异性分析结果 | 第44-46页 |
| ·细胞总RNA核酸电泳图 | 第46-47页 |
| ·几种c DNA定量结果 | 第47页 |
| ·Real-Time PCR对CTCF在敲除细胞(MCF-7/siCTCF3)和野生型细胞中表达量差异性分析结果 | 第47-49页 |
| ·Real-Time PCR对CTCF在敲除细胞(MCF-7/siCTCF4)和野生型MCF-7细胞中表达量差异性分析结果 | 第49-51页 |
| ·Real-Time PCR对CTCF在敲除细胞(MCF-7/siCTCFl、MCF-7/siCTCF2)和野生型MCF-7细胞中表达量差异性分析结果 | 第51-52页 |
| ·结果讨论 | 第52-55页 |
| ·提取细胞总RNA时注意几点 | 第52-53页 |
| ·蛋白含量的测定(BCA蛋白定量试剂盒)原理 | 第53页 |
| ·Real Time PCR结果分析 | 第53页 |
| ·Western Blot结果分析 | 第53页 |
| ·Western Blot和Real Time PCR二者之间结果分析 | 第53-54页 |
| ·CTCF敲除效率分析 | 第54-55页 |
| 第五部分 CTCF基因拯救载体的构建 | 第55-63页 |
| ·材料 | 第55页 |
| ·工具酶及载体 | 第55页 |
| ·试剂盒 | 第55页 |
| ·方法 | 第55-61页 |
| ·突变掉敲除位点后的CTCF-cDNA扩增 | 第55-58页 |
| ·载体p~(IRESPURO3)和CTCF-cDNA分别进行单酶切纯化、连接 | 第58-61页 |
| ·结果 | 第61-62页 |
| ·上下游扩增产物及重构后的CTCF-cDNA琼脂糖凝胶电泳结果 | 第61-62页 |
| ·构建好的拯救载体测序验证 | 第62页 |
| ·结果讨论 | 第62-63页 |
| 结论 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-70页 |
| 附录 | 第70-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 | 第80-81页 |
| 稿件录用函 | 第81-82页 |
