| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 缩略词（Abbreviation) | 第14-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-31页 |
| 1.1 纤维素 | 第16-17页 |
| 1.1.1 纤维素分子结构与性质 | 第16-17页 |
| 1.1.2 纤维素的生物降解 | 第17页 |
| 1.2 纤维素酶 | 第17-23页 |
| 1.2.1 纤维素酶的来源及微生物降解纤维素的策略 | 第18-19页 |
| 1.2.2 纤维素酶的组成 | 第19-20页 |
| 1.2.3 纤维素酶的分子结构 | 第20-22页 |
| 1.2.3.1 催化结构域(CD) | 第21页 |
| 1.2.3.2 结合结构域(CBD) | 第21-22页 |
| 1.2.3.3 Linker区 | 第22页 |
| 1.2.4 纤维素酶的应用前景及存在的问题 | 第22-23页 |
| 1.3 蛋白折叠与内质网质量控制(endoplasmic reticulum quality control,ERQC) | 第23-28页 |
| 1.3.1 内质网质量控制及其意义 | 第23-25页 |
| 1.3.2 Calnexin/Calreticulin循环 | 第25-28页 |
| 1.4 瑞氏木霉纤维素酶的分泌及研究进展 | 第28-29页 |
| 1.5 论文的立题依据及工作内容 | 第29-31页 |
| 第二章 瑞氏木霉中参与蛋白质折叠的内质网因子缺失菌的构建及性状分析 | 第31-56页 |
| 2.1 实验材料及试剂 | 第32-34页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第32页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第32页 |
| 2.1.3 培养基 | 第32-33页 |
| 2.1.3.1 瑞氏木霉培养基 | 第32-33页 |
| 2.1.3.2 大肠杆菌LB培养基 | 第33页 |
| 2.1.4 本章中用到的引物及序列 | 第33-34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-46页 |
| 2.2.1 菌种保藏技术 | 第34-35页 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第35页 |
| 2.2.3 大肠杆菌转化 | 第35-36页 |
| 2.2.4 质粒提取 | 第36页 |
| 2.2.5 瑞氏木霉的培养 | 第36-37页 |
| 2.2.6 引物设计与PCR扩增 | 第37页 |
| 2.2.7 Gateway敲除系统 | 第37-39页 |
| 2.2.8 BP Clone反应 | 第39页 |
| 2.2.9 真菌转化 | 第39-40页 |
| 2.2.10 真菌基因组DNA的提取 | 第40-41页 |
| 2.2.11 酶活测定 | 第41-42页 |
| 2.2.11.1 pNP标准曲线的制作 | 第41页 |
| 2.2.11.2 pNPC酶活测定 | 第41页 |
| 2.2.11.3 pNPG酶活测定 | 第41-42页 |
| 2.2.11.4 CMC酶活测定 | 第42页 |
| 2.2.11.5 Avicel酶活测定 | 第42页 |
| 2.2.12 Southern blot | 第42-46页 |
| 2.2.12.1 基因组提取 | 第42-43页 |
| 2.2.12.2 酶切基因组 | 第43页 |
| 2.2.12.3 乙醇沉淀酶切后的基因组 | 第43-44页 |
| 2.2.12.4 标记探针 | 第44页 |
| 2.2.12.5 电泳 | 第44页 |
| 2.2.12.6 转膜 | 第44-45页 |
| 2.2.12.7 固定 | 第45页 |
| 2.2.12.8 预杂交与杂交 | 第45页 |
| 2.2.12.9 Strigency Washes | 第45页 |
| 2.2.12.10 免疫检测 | 第45-46页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第46-54页 |
| 2.3.1 cne1、prpA敲除载体的构建 | 第46-47页 |
| 2.3.1.1 cne1、prpA上下游同源臂的扩增 | 第46-47页 |
| 2.3.1.2 BP Clone反应及转化子的挑选 | 第47页 |
| 2.3.2 真菌转化及Δcne1及ΔprpA菌株的验证 | 第47-49页 |
| 2.3.3 Southern blot验证 | 第49-50页 |
| 2.3.4 缺失菌性质检测 | 第50-53页 |
| 2.3.4.1 Δcne1与ΔprpA菌株在不同碳源上的生长 | 第50-51页 |
| 2.3.4.2 Δcne1、ΔprpA菌株在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)平板上水解圈 | 第51-52页 |
| 2.3.4.3 Δcne1、ΔprpA菌株pNPC酶活测定 | 第52-53页 |
| 2.3.5 Δcne1菌株酶活性质的测定 | 第53-54页 |
| 2.4 小结与讨论 | 第54-56页 |
| 第三章 △cne1菌株纤维素外切酶CBHI的产生、分泌动力学及稳定性分析 | 第56-65页 |
| 3.1 实验材料及试剂 | 第56-58页 |
| 3.1.1 菌种 | 第56页 |
| 3.1.2 瑞氏木霉MA培养基 | 第56-57页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第57页 |
| 3.1.4 缓冲液的配制 | 第57页 |
| 3.1.5 蛋白电泳 | 第57-58页 |
| 3.1.5.1 SDS-PAGE胶的配制 | 第57-58页 |
| 3.1.5.2 蛋白电泳 | 第58页 |
| 3.1.5.3 蛋白考马斯亮蓝染色 | 第58页 |
| 3.2 实验方法 | 第58-60页 |
| 3.2.1 胞内全蛋白的提取 | 第58-59页 |
| 3.2.2 蛋白胞内生成和胞外分泌情况分析 | 第59页 |
| 3.2.3 CBHI胞内及胞外稳定性分析 | 第59页 |
| 3.2.4 Western blot检测 | 第59-60页 |
| 3.3 结果与分析 | 第60-64页 |
| 3.3.1 胞内CBHI产生情况分析 | 第60-61页 |
| 3.3.2 胞外CBHI分泌情况分析 | 第61页 |
| 3.3.3 胞内蛋白稳定性测定 | 第61-63页 |
| 3.3.4 胞外蛋白稳定性分析 | 第63-64页 |
| 3.4 小结与讨论 | 第64-65页 |
| 第四章 发酵液中CBHI的分离纯化 | 第65-76页 |
| 4.1 实验材料 | 第65-66页 |
| 4.1.1 菌种 | 第65页 |
| 4.1.2 瑞氏木霉MA培养基 | 第65页 |
| 4.1.3 主要仪器及试剂 | 第65-66页 |
| 4.1.4 缓冲液及配制 | 第66页 |
| 4.2 实验方法 | 第66-68页 |
| 4.2.1 发酵液的收集 | 第66页 |
| 4.2.2 发酵液的浓缩 | 第66-67页 |
| 4.2.3 硫胺沉淀及浓缩后除盐 | 第67页 |
| 4.2.4 超滤离心更换蛋白样品的缓冲液 | 第67页 |
| 4.2.5 DEAE阴离子交换层析层析柱的装配 | 第67-68页 |
| 4.2.6 蛋白电泳 | 第68页 |
| 4.2.7 pNPC水解酶活性测定 | 第68页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第68-74页 |
| 4.3.1 发酵液中蛋白的浓缩 | 第68-69页 |
| 4.3.2 DEAE阴离子交换层析 | 第69-71页 |
| 4.3.3 Mono Q阴离子交换层析 | 第71-73页 |
| 4.3.4 样品及各洗脱峰pNPC酶活的测定 | 第73页 |
| 4.3.5 发酵液中全蛋白分析 | 第73-74页 |
| 4.4 小结与讨论 | 第74-76页 |
| 第五章 瑞氏木霉内质网中参与CBHI折叠相关分子伴侣的分离 | 第76-93页 |
| 5.1 材料和方法 | 第76-79页 |
| 5.1.1 菌株和质粒 | 第76-77页 |
| 5.1.2 瑞氏木霉培养基和培养条件 | 第77页 |
| 5.1.3 大肠杆菌LB培养基 | 第77页 |
| 5.1.4 主要试剂 | 第77页 |
| 5.1.5 本章用到的蛋白缓冲液及其配方 | 第77-78页 |
| 5.1.6 本章中用到的引物 | 第78-79页 |
| 5.2 实验方法 | 第79-81页 |
| 5.2.1 菌种保藏技术 | 第79页 |
| 5.2.2 瑞氏木霉的培养 | 第79页 |
| 5.2.3 大肠杆菌感受态的制备、大肠转化及质粒提取 | 第79页 |
| 5.2.4 真菌转化及真菌基因组提取 | 第79页 |
| 5.2.5 Western blot检测 | 第79页 |
| 5.2.6 蛋白银染 | 第79页 |
| 5.2.7 蛋白浓缩—三氯乙酸(TCA)沉淀 | 第79-80页 |
| 5.2.8 微粒体(microsome)的提取 | 第80页 |
| 5.2.9 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP) | 第80-81页 |
| 5.3 结果与分析 | 第81-91页 |
| 5.3.1 CBHI抗体的合成及其免疫沉淀反应 | 第81-82页 |
| 5.3.2 CBHI加标签菌株的构建 | 第82-88页 |
| 5.3.2.1 同源替换盒的构建 | 第83页 |
| 5.3.2.2 加标签菌株的验证 | 第83-85页 |
| 5.3.2.3 CBHI加标签菌株(CBHI Tag)的改造 | 第85-88页 |
| 5.3.3 CBHI内质网折叠相关分子伴侣的分离 | 第88-91页 |
| 5.3.3.1 微粒体(microsome)的分离分析 | 第88-89页 |
| 5.3.3.2 免疫共沉淀 | 第89-91页 |
| 5.4 小结与分析 | 第91-93页 |
| 全文总结与展望 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-102页 |
| 致谢 | 第102-103页 |
| 附件 | 第103页 |
