| 摘要 | 第3-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 前言 | 第15-18页 |
| 第一部分 IgE重链3-4区表达质粒的构建及鉴定 | 第18-32页 |
| 一 材料 | 第18-19页 |
| 1.1 主要试剂 | 第18页 |
| 1.2 菌株和质粒 | 第18页 |
| 1.3 引物合成 | 第18页 |
| 1.4 血清来源 | 第18页 |
| 1.5 主要仪器 | 第18-19页 |
| 二 方法 | 第19-22页 |
| 2.1 引物设计 | 第19页 |
| 2.2 外周血淋巴细胞分离 | 第19页 |
| 2.3 RNA提取 | 第19-20页 |
| 2.4 目的基因调取 | 第20-21页 |
| 2.4.1 RT反应体系 | 第20页 |
| 2.4.2 PCR扩增 | 第20-21页 |
| 2.5 重组表达载体IgE Cε3-Cε4-pET28a(+)的构建 | 第21-22页 |
| 2.5.1 目的基因及质粒的酶切、回收 | 第21页 |
| 2.5.2 目的基因片段与载体的连接 | 第21页 |
| 2.5.3 感受态细胞的制备 | 第21页 |
| 2.5.4 转化 | 第21-22页 |
| 2.6 重组克隆的筛选及鉴定 | 第22页 |
| 2.6.1 初步鉴定 | 第22页 |
| 2.6.2 DNA酶切鉴定 | 第22页 |
| 2.6.3 PCR鉴定 | 第22页 |
| 2.7 基因序列测定 | 第22页 |
| 三 结果 | 第22-29页 |
| 3.1 RT-PCR结果 | 第22-24页 |
| 3.1.1 总RNA产物的琼脂糖电泳分析 | 第22-23页 |
| 3.1.2 PCR条件优化 | 第23-24页 |
| 3.2 IgE Cε3-Cε4-pET28a(+)重组质粒的构建及鉴定 | 第24-28页 |
| 3.2.1 重组质粒构建 | 第24页 |
| 3.2.2 限制性酶切鉴定重组质粒IgE Cε3-Cε4-pET28a(+) | 第24-25页 |
| 3.2.3 测序鉴定 | 第25-28页 |
| 3.3 IgE Cε3-Cε4-pET28a(+)重组表达质粒的PCR鉴定 | 第28-29页 |
| 四 讨论 | 第29-31页 |
| 五 小结 | 第31-32页 |
| 第二部分 重组蛋白的纯化及鉴定 | 第32-46页 |
| 一 材料 | 第32-34页 |
| 1.1 主要试剂 | 第32页 |
| 1.2 主要仪器 | 第32页 |
| 1.3 溶液配制 | 第32-34页 |
| 1.3.1 SDS-PAGE试剂 | 第32-33页 |
| 1.3.2 LB培养基 | 第33页 |
| 1.3.3 目的蛋白变性液、复性液以及蛋白纯化缓冲液 | 第33-34页 |
| 二 方法 | 第34-37页 |
| 2.1 重组质粒的诱导表达 | 第34页 |
| 2.2 蛋白表达条件的优化 | 第34-35页 |
| 2.2.1.最佳诱导时机的选择 | 第34-35页 |
| 2.2.2 最佳IPTG诱导浓度的选择 | 第35页 |
| 2.2.3 可溶性表达条件的选择 | 第35页 |
| 2.3 重组蛋白的纯化 | 第35-36页 |
| 2.3.1 包涵体的提取 | 第35页 |
| 2.3.2 包涵体的洗涤 | 第35-36页 |
| 2.3.3 变性产物的纯化 | 第36页 |
| 2.3.4 包涵体的复性 | 第36页 |
| 2.4 重组蛋白的细胞免疫荧光鉴定 | 第36-37页 |
| 三 结果 | 第37-41页 |
| 3.1 重组质粒的表达 | 第37页 |
| 3.2 表达条件的优化 | 第37-40页 |
| 3.3 包涵体的提取和初步洗涤 | 第40页 |
| 3.4 目的蛋白的纯化-Ni-NTA亲和纯化和复性 | 第40-41页 |
| 3.5 重组蛋白的定量检测 | 第41页 |
| 3.6 细胞免疫荧光对重组蛋白的鉴定 | 第41页 |
| 四 讨论 | 第41-45页 |
| 五 小结 | 第45-46页 |
| 第三部分 多克隆抗体的制备及鉴定 | 第46-53页 |
| 一 材料 | 第46-47页 |
| 1.1 试剂 | 第46页 |
| 1.2 细胞与动物 | 第46页 |
| 1.3 主要仪器 | 第46页 |
| 1.4 主要试剂配制 | 第46-47页 |
| 二 方法 | 第47-49页 |
| 2.1 抗原制备 | 第47页 |
| 2.2 动物免疫 | 第47-48页 |
| 2.3 效价测定 | 第48页 |
| 2.4 多克隆抗体的Western blot鉴定 | 第48页 |
| 2.5 ELISA鉴定 | 第48-49页 |
| 三 结果 | 第49页 |
| 3.1 多克隆抗体的Western blot鉴定 | 第49页 |
| 四 讨论 | 第49-52页 |
| 五 小结 | 第52-53页 |
| 全文小结 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-60页 |
| 附录一 综述 | 第60-67页 |
| 附录二:缩略词 | 第67-68页 |
| 硕士期间发表论文情况 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 统计学证明 | 第70-71页 |
