| 中文摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 缩略语表 | 第13-15页 |
| 第1章 文献综述 | 第15-40页 |
| 1.1 VNN的发现及危害: | 第15-16页 |
| 1.2 VNN的临床表现: | 第16-18页 |
| 1.3 VNN的病理学变化: | 第18-19页 |
| 1.4 VNN的流行病学 | 第19-23页 |
| 1.4.1 易感水生动物 | 第19-21页 |
| 1.4.2 传播途径 | 第21-23页 |
| 1.5 VNN病原学 | 第23-26页 |
| 1.5.1 VNNV的种类和地理分布 | 第23-25页 |
| 1.5.2 VNNV的抵抗力 | 第25页 |
| 1.5.3 VNNV的组织培养特性 | 第25-26页 |
| 1.6 VNN的分子生物学 | 第26-28页 |
| 1.6.1 VNNV基因组的结构 | 第26-28页 |
| 1.6.2 VNNV结构蛋白的结构与功能 | 第28页 |
| 1.7 检测VNN感染的诊断方法 | 第28-31页 |
| 1.7.1 显微镜观察法 | 第28-29页 |
| 1.7.2 免疫学方法 | 第29页 |
| 1.7.3 分子生物学方法 | 第29-30页 |
| 1.7.4 细胞培养法 | 第30-31页 |
| 1.8 VNN的免疫预防 | 第31-32页 |
| 1.9 荧光PCR的概述实时荧光定量PCR技术原理与应用 | 第32-40页 |
| 1.9.1 荧光PCR的概述 | 第32-34页 |
| 1.9.2 荧光染料的引入途径及工作原理 | 第34-38页 |
| 1.9.2.1 SYBR Green Ⅰ的工作原理 | 第34-35页 |
| 1.9.2.2 分子信标(molecular beacon)的工作原理 | 第35-36页 |
| 1.9.2.3 ZaqMan荧光探针的工作原理 | 第36-37页 |
| 1.9.2.4 LUX引物的工作原理 | 第37-38页 |
| 1.9.3 实时荧光定量PCR技术的应用 | 第38页 |
| 1.9.4 存在的问题及应用前景 | 第38-40页 |
| 第2章 研究目的和意义 | 第40-41页 |
| 第3章 鱼类病毒性神经坏死病的病毒的分离与鉴定 | 第41-53页 |
| 3.1 材料和方法 | 第41-47页 |
| 3.1.1 病鱼材料 | 第41页 |
| 3.1.2 细胞 | 第41页 |
| 3.1.3 培养基 | 第41-42页 |
| 3.1.4 引物及酶 | 第42页 |
| 3.1.5 病毒分离 | 第42页 |
| 3.1.5.1 病料处理接种 | 第42页 |
| 3.1.5.2 收集细胞悬液 | 第42页 |
| 3.1.6 病毒的生物学特性 | 第42-43页 |
| 3.1.6.1 病毒滴度(TCID_(50))测定 | 第42-43页 |
| 3.1.6.2 不同细胞的敏感性 | 第43页 |
| 3.1.7 病毒理化特性础 | 第43-46页 |
| 3.1.7.1 热稳定性试验 | 第43页 |
| 3.1.7.2 pH敏感性试验 | 第43-44页 |
| 3.1.7.3 氯仿敏感试验 | 第44-45页 |
| 3.1.7.4 IUDR试验 | 第45-46页 |
| 3.1.8 RT-PCR | 第46-47页 |
| 3.1.8.1 病毒核酸抽提 | 第46页 |
| 3.1.8.2 RT-PCR | 第46-47页 |
| 3.1.8.3 PCR产物检测 | 第47页 |
| 3.1.9 组织病理观察 | 第47页 |
| 3.2 结果 | 第47-51页 |
| 3.2.1 病鱼临床症状 | 第47页 |
| 3.2.2 病毒分离 | 第47-49页 |
| 3.2.2.1 CPE观察 | 第47-48页 |
| 3.2.2.2 RT-PCR鉴定结果 | 第48-49页 |
| 3.2.3 病毒的生物学特性 | 第49-50页 |
| 3.2.3.1 TCID_(50)试验: | 第49页 |
| 3.2.3.2 耐热性试验 | 第49-50页 |
| 3.2.3.3 氯仿敏感试验 | 第50页 |
| 3.2.3.4 pH敏感性试验 | 第50页 |
| 3.2.3.5 IUDR试验结果 | 第50页 |
| 3.2.4 组织病理观察 | 第50-51页 |
| 3.3 讨论 | 第51-53页 |
| 第4章 双抗夹心ELISA检测VNNV方法的建立及应用 | 第53-65页 |
| 4.1 材料与方法 | 第53-58页 |
| 4.1.1 病毒、细胞及试验动物 | 第53-54页 |
| 4.1.2 主要培养基和溶液的配制: | 第54页 |
| 4.1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)的相关试剂 | 第54页 |
| 4.1.4 分泌抗VNNV单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 | 第54-55页 |
| 4.1.4.1 病毒的大量培养及纯化 | 第54-55页 |
| 4.1.4.2 免疫原的制备 | 第55页 |
| 4.1.4.3 免疫 | 第55页 |
| 4.1.4.4 杂交瘤细胞的建立与阳性克隆的筛选 | 第55页 |
| 4.1.5 单抗的大量制备 | 第55页 |
| 4.1.6 单抗的纯化: | 第55-56页 |
| 4.1.7 单克隆抗体特异性 | 第56页 |
| 4.1.8 兔抗VNNV多克隆抗体的制备 | 第56页 |
| 4.1.8.1 免疫原的制备 | 第56页 |
| 4.1.8.2 免疫及血清分离 | 第56页 |
| 4.1.9 检测VNNV ELISA方法的建立 | 第56-58页 |
| 4.1.9.1 ELISA方法的建立与检测步骤 | 第56-57页 |
| 4.1.9.2 ELISA结果判定标准的确定 | 第57页 |
| 4.1.9.8 ELISA特异性试验 | 第57页 |
| 4.1.9.9 临床样品检测 | 第57页 |
| 4.1.9.10 重复性试验 | 第57-58页 |
| 4.1.9.11 保质期试验 | 第58页 |
| 4.2 结果 | 第58-63页 |
| 4.2.1 杂交瘤的稳定性及分泌单抗的间接ELISA效价 | 第58页 |
| 4.2.2 单克隆抗体的特异性 | 第58-59页 |
| 4.2.3 单克隆抗体亚型的鉴定 | 第59页 |
| 4.2.4 ELISA特异性试验结果 | 第59-60页 |
| 4.2.5 批内可重复性试验结果 | 第60-62页 |
| 4.2.6 批间重复性试验结果 | 第62页 |
| 4.2.7 临床样品检测结果 | 第62-63页 |
| 4.2.8 保质期试验结果 | 第63页 |
| 4.3 讨论 | 第63-65页 |
| 第5章 鱼类神经坏死病实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用 | 第65-73页 |
| 5.1 材料与方法 | 第66-68页 |
| 5.1.1 病毒和细胞 | 第66页 |
| 5.1.2 引物、探针的设计与合成 | 第66页 |
| 5.1.3 仪器、试剂盒及其它试剂 | 第66页 |
| 5.1.4 病毒滴度的测定 | 第66-67页 |
| 5.1.5 病毒核酸的提取 | 第67页 |
| 5.1.6 常规RT-PCR | 第67页 |
| 5.1.7 荧光RT-PCR检测方法的建立和条件优化 | 第67页 |
| 5.1.8 荧光RT-PCR的特异性试验 | 第67页 |
| 5.1.9 荧光RT-PCR与普通RT-PCR灵敏度比较 | 第67页 |
| 5.1.10 荧光RT-PCR的重复性试验 | 第67页 |
| 5.1.11 荧光RT-PCR的临床检测 | 第67-68页 |
| 5.2 结果与分析 | 第68-71页 |
| 5.2.1 荧光RT-PCR反应条件的优化 | 第68页 |
| 5.2.2 荧光RT-PCR方法的特异性 | 第68页 |
| 5.2.3 荧光RT-PCR与普通RT-PCR灵敏度比较 | 第68-69页 |
| 5.2.4 荧光RT-PCR稳定性和重复性实验 | 第69-70页 |
| 5.2.5 荧光RT-PCR方法的临床检测 | 第70-71页 |
| 5.3 讨论 | 第71-73页 |
| 第6章 6株鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)RNA2片段的分子特征和遗传发生分析 | 第73-82页 |
| 6.1 材料与方法 | 第74-75页 |
| 6.1.1 病毒和细胞 | 第74页 |
| 6.1.2 主要试剂 | 第74页 |
| 6.1.3 引物设计与合成 | 第74页 |
| 6.1.4 病毒RNA的提取 | 第74页 |
| 6.1.5 RT-PCR扩增 | 第74-75页 |
| 6.1.6 扩增产物的克隆和酶切鉴定 | 第75页 |
| 6.1.7 序列测定和分析 | 第75页 |
| 6.2 结果 | 第75-80页 |
| 6.2.1 RT-PCR扩增结果 | 第75页 |
| 6.2.2 重组质粒的酶切鉴定 | 第75-76页 |
| 6.2.3 RNA2片段的核苷酸序列及推导的氨基酸序列比较 | 第76页 |
| 6.2.4 VNNV衣壳蛋白RNA2片段限制性内切酶位点分析 | 第76-77页 |
| 6.2.5 6株VNNV分离株RNA2片段序列与国内外毒株RNA2序列比较分析 | 第77-79页 |
| 6.2.6 VNNV分离株推导的氨基酸序列分析 | 第79-80页 |
| 6.3 讨论 | 第80-82页 |
| 第7章 鱼类神经坏死病病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性研究 | 第82-94页 |
| 7.1 材料与方法 | 第82-88页 |
| 7.1.1 病毒、载体和细胞 | 第82-83页 |
| 7.1.2 引物 | 第83页 |
| 7.1.3 细菌及载体 | 第83-84页 |
| 7.1.4 酶及化学试剂等 | 第84-85页 |
| 7.1.5 主要培养基和溶液的配制 | 第85-86页 |
| 7.1.6 穿梭载体Bacmid的提取液 | 第86页 |
| 7.1.7 SDS-PAGE、Western-blotting的相关试剂 | 第86-87页 |
| 7.1.8 病毒RNA的提取 | 第87页 |
| 7.1.9 VNNV cp基因的RT-PCR扩增 | 第87页 |
| 7.1.10 VNNV cp基因的克隆 | 第87页 |
| 7.1.11 重组穿梭载体Bacmid-cp的构建 | 第87页 |
| 7.1.12 重组杆状病毒(AcNPV-cp)的获得 | 第87页 |
| 7.1.13 SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达的目的蛋白 | 第87-88页 |
| 7.1.14 体外表达CP蛋白的粗纯化 | 第88页 |
| 7.1.15 电镜观察 | 第88页 |
| 7.2 结果和分析 | 第88-92页 |
| 7.2.1 PCR扩增cp基因: | 第88-89页 |
| 7.2.2 pMD18-cp克隆载体的构建 | 第89页 |
| 7.2.3 VNNV cp基因的克隆及鉴定 | 第89页 |
| 7.2.4 穿梭载体Bacmid-cp的构建 | 第89-90页 |
| 7.2.5 重组杆状病毒AcNPV-cp的获得 | 第90-91页 |
| 7.2.6 体外表达蛋白的鉴定 | 第91页 |
| 7.2.7 电镜观察 | 第91-92页 |
| 7.3 讨论 | 第92-94页 |
| 第8章 全文总结 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-105页 |
| CURRICULUM VITAE | 第105-107页 |
| 致谢 | 第107页 |
