| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第1章 文献综述 | 第13-24页 |
| 1.1 HMGB1 分子特征 | 第13-14页 |
| 1.2 HMGB1 翻译后修饰与其定位、分泌的关系 | 第14-15页 |
| 1.3 HMGB1 受体及信号转导途径 | 第15-17页 |
| 1.3.1 HMGB1 和晚期糖基化终末产物受体 | 第15页 |
| 1.3.2 HMGB1 和 Toll 样受体 | 第15-17页 |
| 1.4 高迁移率族蛋白 B1------启动免疫应答的重要信号分子 | 第17-20页 |
| 1.4.1 HMGB1----启动免疫应答的预警素 | 第18页 |
| 1.4.2 HMGB1 和固有免疫 | 第18页 |
| 1.4.3 HMGB1 和适应性免疫 | 第18-20页 |
| 1.4.3.1 HMGB1 介导的树突状细胞在适应性免疫方面的作用 | 第19页 |
| 1.4.3.2 HMGB1 直接激活 T 细胞 | 第19-20页 |
| 1.4.3.3 HMGB1-----一种内源性免疫佐剂 | 第20页 |
| 1.5 本研究的目的和意义 | 第20-24页 |
| 1.5.1 目的 | 第20-21页 |
| 1.5.2 意义 | 第21-24页 |
| 1.5.2.1 七鳃鳗在进化和发育生物学研究中的重要意义 | 第21页 |
| 1.5.2.2 七鳃鳗具有特有的免疫器官及适应性免疫系统 | 第21-23页 |
| 1.5.2.3 HMGB1 基因研究现状 | 第23-24页 |
| 第2章 七鳃鳗 HMGB 家族基因的分子克隆及生物信息学分析 | 第24-46页 |
| 2.1 七鳃鳗白细胞 HMGB 家族基因的克隆 | 第24-32页 |
| 2.1.1 材料 | 第24-25页 |
| 2.1.2 方法 | 第25-30页 |
| 2.1.2.1 引物设计 | 第25页 |
| 2.1.2.2 七鳃鳗白细胞的分离 | 第25-26页 |
| 2.1.2.3 提取总 RNA | 第26-27页 |
| 2.1.2.4 逆转录-聚合酶链式反应 (RT-PCR) | 第27-29页 |
| 2.1.2.5 目的片段与载体相连及鉴定 | 第29-30页 |
| 2.1.3 结果 | 第30-32页 |
| 2.1.3.1 RT-PCR | 第30页 |
| 2.1.3.2 阳性转化子筛选 | 第30-32页 |
| 2.2 RT-PCR 法检测七鳃鳗 HMGB1/2/X 基因在组织中的表达 | 第32-33页 |
| 2.2.1 材料 | 第32页 |
| 2.2.2 方法 | 第32页 |
| 2.2.3 结果 | 第32-33页 |
| 2.3 七鳃鳗 HMGB 家族基因生物信息学分析 | 第33-36页 |
| 2.3.1 数据库和软件 | 第33页 |
| 2.3.2 方法 | 第33页 |
| 2.3.2.1 一级结构分析 | 第33页 |
| 2.3.2.2 同源序列比对 | 第33页 |
| 2.3.3 结果 | 第33-36页 |
| 2.3.3.1 理化性质分析 | 第33-35页 |
| 2.3.3.2 同源序列比对 | 第35-36页 |
| 2.4 脊椎动物 HMGB 家族进化分析 | 第36-43页 |
| 2.4.1 数据库和软件 | 第36页 |
| 2.4.2 方法 | 第36-37页 |
| 2.4.2.1 HMGB 家族成员的识别 | 第36-37页 |
| 2.4.2.2 序列同源性比对 | 第37页 |
| 2.4.2.3 系统发育分析 | 第37页 |
| 2.4.2.4 结构域和保守基序分析 | 第37页 |
| 2.4.3 结果 | 第37-43页 |
| 2.4.3.1 序列分析 | 第37-39页 |
| 2.4.3.2 系统发育分析 | 第39-40页 |
| 2.4.3.3 HMGB 结构域与基序分析 | 第40-43页 |
| 2.5 讨论 | 第43-45页 |
| 2.6 小结 | 第45-46页 |
| 第3章 七鳃鳗 HMGB1 基因表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备 | 第46-67页 |
| 3.1 实时荧光定量 PCR 法检测 HMGB1 的表达 | 第46-50页 |
| 3.1.1 材料 | 第46-47页 |
| 3.1.2 方法 | 第47-49页 |
| 3.1.2.1 分离七鳃鳗外周血白细胞 | 第47页 |
| 3.1.2.2 Total RNA 提取 | 第47页 |
| 3.1.2.3 RNA 质量检测 | 第47-48页 |
| 3.1.2.4 Real Time PCR 法检测目的基因的相对表达量 | 第48-49页 |
| 3.1.3 结果 | 第49-50页 |
| 3.2 七鳃鳗 HMGB1 基因原核表达及重组蛋白纯化 | 第50-60页 |
| 3.2.1 材料 | 第50-51页 |
| 3.2.2 方法 | 第51-57页 |
| 3.2.2.1 设计引物 | 第51页 |
| 3.2.2.2 PCR 扩增 | 第51-52页 |
| 3.2.2.3 目的片段回收 | 第52页 |
| 3.2.2.4 Vector DNA 的制备 | 第52页 |
| 3.2.2.5 目的片段与载体连接 | 第52页 |
| 3.2.2.6 转化 | 第52-53页 |
| 3.2.2.7 重组表达菌的鉴定 | 第53页 |
| 3.2.2.8 测序分析 | 第53页 |
| 3.2.2.9 阳性重组子的诱导表达 | 第53-54页 |
| 3.2.2.10 采用可溶性蛋白的提取方法对诱导表达的重组蛋白进行提取和鉴定 | 第54页 |
| 3.2.2.11 SDS-PAGE 鉴定 | 第54-55页 |
| 3.2.2.12 Western blot 鉴定 | 第55页 |
| 3.2.2.13 重组蛋白的纯化 | 第55-57页 |
| 3.2.2.14 重组蛋白浓度测定 | 第57页 |
| 3.2.3 结果 | 第57-60页 |
| 3.3 兔抗七鳃鳗 HMGB1 蛋白多克隆抗体的制备及检测 | 第60-65页 |
| 3.3.1 材料 | 第60-61页 |
| 3.3.2 方法 | 第61-63页 |
| 3.3.2.1 免疫原：rLj-HMGB1 蛋白 | 第61页 |
| 3.3.2.2 免疫血清的收集抗原与佐剂乳化 | 第61页 |
| 3.3.2.3 抗体制备 | 第61页 |
| 3.3.2.4 多克隆抗体纯化 | 第61-62页 |
| 3.3.2.5 ELISA 法测定抗体效价 | 第62-63页 |
| 3.3.2.6 抗体结合能力检测 | 第63页 |
| 3.3.3 结果 | 第63-65页 |
| 3.3.3.1 兔抗七鳃鳗 HMGB1 多克隆抗体的制备和效价测定 | 第63-64页 |
| 3.3.3.2 抗体结合能力检测 | 第64-65页 |
| 3.4 讨论 | 第65-66页 |
| 3.5 小结 | 第66-67页 |
| 第4章 重组蛋白生物学活性测定 | 第67-81页 |
| 4.1 七鳃鳗 HMGB1 蛋白在口腔腺分泌特性检测 | 第67-68页 |
| 4.1.1 材料 | 第67页 |
| 4.1.2 方法 | 第67-68页 |
| 4.1.2.1 SDS-PAGE | 第67-68页 |
| 4.1.2.2 Western blot 检测 | 第68页 |
| 4.1.3 结果 | 第68页 |
| 4.2 免疫组化法检测 HMGB1 在口腔腺中的分布情况 | 第68-71页 |
| 4.2.1 材料 | 第68-69页 |
| 4.2.2 方法 | 第69-70页 |
| 4.2.2.1 石蜡切片的制备 | 第69页 |
| 4.2.2.2 HE 染色 | 第69页 |
| 4.2.2.3 免疫组化染色 | 第69-70页 |
| 4.2.3 结果 | 第70-71页 |
| 4.3 EMSA 法验证 rLj-HMGB1 结合 DNA | 第71-74页 |
| 4.3.1 材料 | 第71页 |
| 4.3.2 方法 | 第71-72页 |
| 4.3.3 结果 | 第72-74页 |
| 4.4 七鳃鳗 HMGB1 保护 DNA 免受 DNA 酶水解 | 第74-75页 |
| 4.4.1 材料 | 第74页 |
| 4.4.2 方法 | 第74-75页 |
| 4.4.3 结果 | 第75页 |
| 4.5 七鳃鳗 HMGB1 促进 THP1 细胞释放炎症因子 | 第75-77页 |
| 4.5.1 材料 | 第75页 |
| 4.5.2 方法 | 第75页 |
| 4.5.3 结果 | 第75-77页 |
| 4.6 七鳃鳗 HMGB1 促进 MCF-7 细胞增殖 | 第77-78页 |
| 4.6.1 材料 | 第77页 |
| 4.6.2 方法 | 第77页 |
| 4.6.3 结果 | 第77-78页 |
| 4.7 讨论 | 第78-79页 |
| 4.8 小结 | 第79-81页 |
| 第5章 七鳃鳗 HMGB1 基因真核表达载体构建及鉴定 | 第81-93页 |
| 5.1 七鳃鳗 HMGB1 基因真核表达载体构建 | 第81-85页 |
| 5.1.1 材料 | 第81页 |
| 5.1.2 方法 | 第81-84页 |
| 5.1.2.1 设计引物 | 第81页 |
| 5.1.2.2 Insert DNA 的制备 | 第81-82页 |
| 5.1.2.3 Vector DNA 的制备 | 第82-83页 |
| 5.1.2.4 目的片段与载体连接 | 第83页 |
| 5.1.2.5 转化和筛选阳性克隆 | 第83页 |
| 5.1.2.6 提取质粒 | 第83-84页 |
| 5.1.2.7 测序分析 | 第84页 |
| 5.1.3 结果 | 第84-85页 |
| 5.2 真核表达载体 pIRES2-AcGFP1-Nuc-LjHMGB1 在 HeLa 细胞中表达 | 第85-88页 |
| 5.2.1 材料 | 第85页 |
| 5.2.2 方法 | 第85-86页 |
| 5.2.2.1 细胞培养基配制 | 第85页 |
| 5.2.2.2 细胞培养方法 | 第85-86页 |
| 5.2.3 结果 | 第86-88页 |
| 5.3 真核表达载体 pIRES2-AcGFP1-Nuc-LjHMGB1 在七鳃鳗类淋巴细胞中表达 | 第88-90页 |
| 5.3.1 材料 | 第88页 |
| 5.3.2 方法 | 第88-89页 |
| 5.3.2.1 细胞培养基配制 | 第88页 |
| 5.3.2.2 细胞培养方法 | 第88-89页 |
| 5.3.3 结果 | 第89-90页 |
| 5.3.3.1 GFP 在七鳃鳗类淋巴细胞中表达 | 第89页 |
| 5.3.3.2 LjHMGB1 蛋白在七鳃鳗类淋巴细胞中表达 | 第89-90页 |
| 5.4 讨论 | 第90-91页 |
| 5.5 小结 | 第91-93页 |
| 第6章 结论 | 第93-94页 |
| 本论文的创新点 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-102页 |
| 附录 | 第102-117页 |
| 附录 1 七鳃鳗 HMGB1/2/X 测序结果 | 第102-106页 |
| 附录 2 植物、无脊椎动物、脊椎动物的 HMGB 家族氨基酸序列 | 第106-111页 |
| 附录 3 实时荧光定量 PCR 管家基因和目的基因的标准曲线 | 第111-114页 |
| 附录 4 pET-28a vector information | 第114-115页 |
| 附录 5 In-Fusion 基因克隆方法 | 第115-116页 |
| 附录 6 pIRES2-AcGFP1-Nuc vector information | 第116-117页 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 | 第117-118页 |
| 主持科研项目名称 | 第118-119页 |
| 致谢 | 第119页 |
