| 第一篇 可溶性单链抗体的GST活性研究 | 第15-46页 |
| 第一章 前言 | 第15-17页 |
| 第二章 可溶性单链抗体的制备 | 第17-28页 |
| 第一节 序言 | 第17-18页 |
| 第二节 可溶性单链抗体的表达及其分离纯化 | 第18-27页 |
| 一 实验材料 | 第18-20页 |
| 1.1 主要试剂 | 第18页 |
| 1.2 实验仪器 | 第18-19页 |
| 1.3 主要溶液的配制 | 第19-20页 |
| 二 实验方法 | 第20-22页 |
| 2.1 单链抗体的诱导表达 | 第20页 |
| 2.2 单链抗体的分离纯化 | 第20-21页 |
| 2.3 单链抗体的鉴定 | 第21-22页 |
| 三 结果分析 | 第22-25页 |
| 3.1 单链抗体的诱导表达 | 第22页 |
| 3.2 单链抗体的分离纯化 | 第22-24页 |
| 3.3 单链抗体的鉴定 | 第24-25页 |
| 四 讨论 | 第25-27页 |
| 本章小结 | 第27-28页 |
| 第三章 可溶性单链抗体的GST活性研究 | 第28-40页 |
| 第一节 序言 | 第28-29页 |
| 第二节 可溶性单链抗体的GST活性研究 | 第29-40页 |
| 一 实验材料 | 第29页 |
| 1.1 主要试剂 | 第29页 |
| 1.2 实验仪器 | 第29页 |
| 二 实验方法 | 第29-31页 |
| 2.1 结合常数的测定 | 第29-30页 |
| 2.2 GST活力的测定 | 第30-31页 |
| 2.3 scFv2F3的化学修饰 | 第31页 |
| 2.4 蛋白质含量测定 | 第31页 |
| 2.5 最适温度和最适pH值的测定 | 第31页 |
| 2.6 动力学常数的测定 | 第31页 |
| 三 结果与讨论 | 第31-40页 |
| 3.1 结合常数的测定 | 第32-33页 |
| 3.2 单链抗体scFv2F3的GST活力 | 第33-37页 |
| 3.3 最适温度和最适pH值 | 第37页 |
| 3.4 scFv 2F3的动力学分析 | 第37-40页 |
| 本章小结 | 第40页 |
| 参考文献 | 第40-46页 |
| 第二篇 含有硒代半胱氨酸的单链抗体在大肠杆菌中的表达 | 第46-108页 |
| 第一章 前言 | 第46-50页 |
| 第二章 含有硒代半胱氨酸的单链抗体在E.coli中的表达 | 第50-81页 |
| 第一节 序言 | 第50-51页 |
| 第二节 目的基因在表达载体pET21a(+)中的构建 | 第51-70页 |
| 一 实验材料 | 第51-52页 |
| 1.1 主要试剂 | 第51页 |
| 1.2 菌株与质粒 | 第51页 |
| 1.3 培养基及缓冲液 | 第51-52页 |
| 1.4 主要仪器 | 第52页 |
| 二 实验方法 | 第52-55页 |
| 2.1 质粒的提取 | 第52页 |
| 2.2 目的基因的获得 | 第52-53页 |
| 2.3 琼脂糖凝胶电泳 | 第53页 |
| 2.4 目的片段的回收 | 第53页 |
| 2.5 限制性内切酶消化DNA | 第53-54页 |
| 2.6 酶切产物的连接 | 第54页 |
| 2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第54-55页 |
| 2.8 连接产物的转化 | 第55页 |
| 2.9 阳性克隆的筛选及其鉴定 | 第55页 |
| 2.10 重组质粒及其菌种的保存 | 第55页 |
| 三 结果分析 | 第55-67页 |
| 3.1 重组质粒pEF的构建 | 第55-63页 |
| 3.1.1 目的基因片段EF的扩增 | 第55-56页 |
| 3.1.2 PCR产物的酶切鉴定 | 第56-57页 |
| 3.1.3 载体pET21a(+)的酶切鉴定 | 第57-59页 |
| 3.1.4 载体和目的基因的双酶切 | 第59-60页 |
| 3.1.5 连接反应 | 第60页 |
| 3.1.6 阳性克隆的筛选 | 第60-63页 |
| 3.2 重组质粒pEFS的构建 | 第63-65页 |
| 3.2.1 目的基因片段EFS的扩增 | 第63-65页 |
| 3.2.2 阳性克隆的筛选 | 第65页 |
| 3.3 重组质粒pEFT和pEFTS的构建 | 第65-67页 |
| 3.3.1 目的基因片段EFT和EFTS的扩增 | 第65-66页 |
| 3.3.2 阳性克隆的筛选 | 第66-67页 |
| 四 讨论 | 第67-70页 |
| 4.1 突变位点的选择 | 第67-68页 |
| 4.2 利用聚合酶链式反应技术获得目的基因 | 第68-70页 |
| 第三节 含有硒代半胱氨酸的单链抗体基因的表达 | 第70-80页 |
| 一 实验材料 | 第70页 |
| 1.1 主要试剂 | 第70页 |
| 1.2 实验仪器 | 第70页 |
| 1.3 主要溶液的配制 | 第70页 |
| 二 实验方法 | 第70-74页 |
| 2.1 转化 | 第70-71页 |
| 2.2 工程菌的诱导表达 | 第71-73页 |
| 2.2.1 工程菌BL21(DE3)-pEFS诱导表达条件的优化 | 第71页 |
| 2.2.2 菌株BL21(DE3)-pEFS／pSU、BL21(DE3)-pEF／pSU和BL21(DE3)-pE／pSU的诱导表达 | 第71-72页 |
| 2.2.3 菌株BL21(DE3)-pEFT／pSU和BL21(DE3)-pEFTS／pSU的诱导表达 | 第72-73页 |
| 2.3 表达产物的鉴定 | 第73页 |
| 2.3.1 蛋白质免疫印迹 | 第73页 |
| 2.3.2 ~(75)Se放射性自显影 | 第73页 |
| 2.4 工程菌BL21(DE3)-pE／pSU系列表达产物的分离纯化 | 第73-74页 |
| 三 结果与讨论 | 第74-80页 |
| 3.1 工程菌BL21(DE3)-pEF和BL21(DE3)-pEFS诱导表达的结果 | 第74-75页 |
| 3.2 工程菌BL21(DE3)-pEFS诱导表达条件的优化 | 第75-76页 |
| 3.3 工程菌BL21(DE3)-pE／pSU系列诱导表达产物的Western Blot鉴定 | 第76-77页 |
| 3.4 pE系列质粒与pSU质粒的共转化 | 第77-79页 |
| 3.5 ~(75)Se放射性自显影鉴定表达产物 | 第79-80页 |
| 3.6 工程菌BL21(DE3)-pEFTS／pSU表达产物的分离纯化 | 第80页 |
| 本章小结 | 第80-81页 |
| 第三章 含有硒代半胱氨酸的单链抗体与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达 | 第81-93页 |
| 第一节 序言 | 第81-82页 |
| 第二节 目的基因在表达载体pGEX-2T中的构建 | 第82-87页 |
| 一 实验材料 | 第82-83页 |
| 二 实验方法 | 第83页 |
| 三 结果分析 | 第83-87页 |
| 3.1 目的基因片段GF、GFS、GFT和GFTS的扩增 | 第83页 |
| 3.2 PCR产物的酶切鉴定 | 第83-85页 |
| 3.3 阳性克隆的筛选 | 第85-87页 |
| 第三节 含有硒代半胱氨酸的单链抗体与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达 | 第87-92页 |
| 一 实验材料 | 第87页 |
| 二 实验方法 | 第87-88页 |
| 2.1 pG系列质粒与pSU质粒的共转化 | 第87页 |
| 2.2 工程菌BL21(DE3)-pG／pSU系列的诱导表达 | 第87页 |
| 2.3 表达产物的鉴定 | 第87页 |
| 2.4 工程菌BL21(DE3)pG／pSU系列表达产物的分离纯化 | 第87-88页 |
| 三 结果与讨论 | 第88-92页 |
| 3.1 pG系列质粒与pSU质粒的共转化 | 第88页 |
| 3.2 工程菌BL21(DE3)-pG／pSU系列的诱导表达 | 第88-89页 |
| 3.3 工程菌BL21(DE3)-pG／pSU系列表达产物的~(75)Se放射性自显影鉴定 | 第89-90页 |
| 3.4 工程菌BL21(DE3)-pGFTS／pSU表达产物的分离纯化 | 第90-92页 |
| 本章小结 | 第92-93页 |
| 第四章 含有硒代半胱氨酸的单链抗体与信号肽的融合表达 | 第93-105页 |
| 第一节 序言 | 第93-94页 |
| 第二节 目的基因在表达载体pPelB中的构建 | 第94-98页 |
| 一 实验材料 | 第94页 |
| 二 实验方法 | 第94页 |
| 三 结果分析 | 第94-98页 |
| 3.1 目的基因片段PFT、PFS和PFTS的扩增 | 第94-95页 |
| 3.2 PCR产物的酶切鉴定 | 第95-96页 |
| 3.3 阳性克隆的筛选 | 第96-98页 |
| 第三节 含有硒代半胱氨酸的单链抗体与信号肽的融合表达 | 第98-104页 |
| 一 实验材料 | 第98页 |
| 1.1 主要试剂 | 第98页 |
| 1.2 实验仪器 | 第98页 |
| 1.3 主要溶液的配制 | 第98页 |
| 二 实验方法 | 第98-99页 |
| 2.1 pPFTS质粒与pSU质粒的共转化 | 第98页 |
| 2.2 工程菌BL21(DE3)-pP系列的诱导表达 | 第98页 |
| 2.3 表达产物的鉴定 | 第98页 |
| 2.4 工程菌BL21(DE3)-pPFTS／pSU系列表达产物的分离纯化 | 第98-99页 |
| 2.4.1 包涵体的收集及洗涤 | 第98-99页 |
| 2.4.2 电洗脱法收集目的蛋白 | 第99页 |
| 三 结果与讨论 | 第99-104页 |
| 3.1 pPFTS质粒与pSU质粒的共转化 | 第99-100页 |
| 3.2 工程菌BL21(DE3)-pP系列的诱导表达 | 第100-101页 |
| 3.3 含有硒代半胱氨酸的单链抗体的分离纯化 | 第101-102页 |
| 3.4 目的蛋白产物的鉴定 | 第102-104页 |
| 3.5 电洗脱法收集目的蛋白 | 第104页 |
| 本章小结 | 第104-105页 |
| 参考文献 | 第105-108页 |
| 第三篇 文献综述 | 第108-177页 |
| 第一章 酶模拟的理论基础 | 第108-111页 |
| 参考文献 | 第110-111页 |
| 第二章 抗体酶 | 第111-118页 |
| 一 抗体酶的诞生 | 第111-112页 |
| 二 抗体酶的制备 | 第112-113页 |
| 三 抗体酶涉及的领域 | 第113-115页 |
| 四 抗体酶存在的问题及可能的对策 | 第115-116页 |
| 五 抗体酶的应用前景 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-118页 |
| 第三章 谷胱甘肽硫转移酶的结构功能与分类 | 第118-136页 |
| 一 GST的解毒作用 | 第118-120页 |
| 二 GST的晶体结构 | 第120-124页 |
| 三 哺乳动物的GST的分类标准 | 第124-128页 |
| 3.1 Alpha、Mu、Pi类GST | 第126页 |
| 3.2 Theta类GST | 第126-127页 |
| 3.3 Kappa类GST | 第127页 |
| 3.4 Omega类GST | 第127-128页 |
| 四 非哺乳动物GST | 第128-129页 |
| 4.1 Sigma类GST | 第128页 |
| 4.2 Zeta类GST | 第128-129页 |
| 4.3 Beta类GST | 第129页 |
| 五 真菌类GST | 第129-130页 |
| 六 植物类GST--Phi和Tau类GST | 第130页 |
| 七 昆虫GST--类型Ⅰ和类型Ⅱ | 第130-131页 |
| 八 蠕虫GST | 第131页 |
| 九 GST分类的进化意义 | 第131-132页 |
| 参考文献 | 第132-136页 |
| 第四章 谷胱甘肽过氧化物酶的结构与功能 | 第136-141页 |
| 一 GPX的生物学作用 | 第136-137页 |
| 二. GPX的结构 | 第137-139页 |
| 2.1 牛cGPX的二级结构 | 第137页 |
| 2.2 牛cGPX活性中心的结构 | 第137-138页 |
| 2.3 人pGPX的活性中心结构 | 第138-139页 |
| 参考文献 | 第139-141页 |
| 第五章 硒代半胱氨酸的生物合成 | 第141-150页 |
| 一 硒代半胱氨酸表达机制 | 第141-143页 |
| 二 原核生物的硒代半胱氨酸插入元件 | 第143-144页 |
| 三 真核生物的SECIS | 第144-146页 |
| 四 硒蛋白的原核表达 | 第146页 |
| 参考文献 | 第146-150页 |
| 第六章 外源基因在大肠杆菌中高效表达的策略 | 第150-177页 |
| 一 高效表达载体的构建 | 第150-153页 |
| 二 转录调控 | 第153-157页 |
| 2.1 启动子 | 第153-155页 |
| 2.2 转录终止子 | 第155页 |
| 2.3 抗终止子 | 第155-156页 |
| 2.4 严谨调控表达系统 | 第156-157页 |
| 三 翻译调控 | 第157-159页 |
| 3.1 mRNA翻译起始 | 第157-158页 |
| 3.2 翻译起始增强子 | 第158页 |
| 3.3 mRNA的稳定性 | 第158-159页 |
| 3.4 翻译终止 | 第159页 |
| 四 蛋白质定位 | 第159-165页 |
| 4.1 在细胞质中表达 | 第160-161页 |
| 4.2 在周质腔中表达 | 第161-162页 |
| 4.3 细胞外分泌表达 | 第162-165页 |
| 五 以融合蛋白形式表达 | 第165-169页 |
| 六 分子伴侣的作用 | 第169页 |
| 七 密码子的使用 | 第169-170页 |
| 八 蛋白质的降解 | 第170-172页 |
| 九 发酵条件 | 第172页 |
| 参考文献 | 第172-177页 |
| 作者简历 | 第177-179页 |
| 致谢 | 第179-181页 |
| 中文摘要 | 第181-185页 |
| ABSTRACT | 第185页 |
| 附录一 载体pET-21a(+)图谱 | 第189-191页 |
| 附录二 载体pPelB图谱 | 第191-193页 |
| 附录三 单链抗体scFv2F3基因序列及其氨基酸序列 | 第193-195页 |
| 附录四 单链抗体2F3及其突变体基因序列和氨基酸序列 | 第195-196页 |
| 附录五 单链抗体2F3及其突变体氨基酸序列 | 第196-197页 |
| 附录六 测序结果 | 第197-202页 |
