| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-35页 |
| ·脂肪酶简介 | 第16-21页 |
| ·脂肪酶的定义 | 第16页 |
| ·脂肪酶的来源 | 第16-17页 |
| ·脂肪酶的结构与催化机理 | 第17-19页 |
| ·脂肪酶的底物特异性 | 第19-21页 |
| ·位置特异性 | 第20页 |
| ·脂肪酸特异性 | 第20-21页 |
| ·立体特异性 | 第21页 |
| ·脂肪酶的应用 | 第21-23页 |
| ·生产单甘酯 | 第21-22页 |
| ·食品工业 | 第22页 |
| ·医药 | 第22页 |
| ·皮革生产 | 第22页 |
| ·纸浆和造纸 | 第22-23页 |
| ·手性化合物的制备 | 第23页 |
| ·洗涤剂 | 第23页 |
| ·脂肪酶基因的表达 | 第23-25页 |
| ·脂肪酶基因在原核细胞中的表达 | 第24页 |
| ·脂肪酶基因在真核细胞中的表达 | 第24-25页 |
| ·米黑根毛霉脂肪酶简介 | 第25-27页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展 | 第27-32页 |
| ·常用表达菌株及表达载体 | 第28-29页 |
| ·表达菌株 | 第28页 |
| ·表达载体 | 第28-29页 |
| ·基因整合及表达调控的机理 | 第29-30页 |
| ·基因整合 | 第29-30页 |
| ·调控机制 | 第30页 |
| ·外源基因自身特性对 P.pastoris 表达系统的影响 | 第30-31页 |
| ·P.pastoris 表达产物的糖基化 | 第31-32页 |
| ·N-和 O-糖基化 | 第31页 |
| ·糖基化对蛋白质产量及功能的影响 | 第31-32页 |
| ·外源蛋白的翻译后修饰 | 第32页 |
| ·本课题的研究意义与内容 | 第32-33页 |
| ·本课题的来源 | 第33页 |
| ·本课题的主要技术路线 | 第33-35页 |
| 第二章 米黑根毛霉脂肪酶基因的克隆和表达载体的构建 | 第35-49页 |
| ·引言 | 第35页 |
| ·实验材料与仪器 | 第35-38页 |
| ·菌种和质粒 | 第35-36页 |
| ·主要生化试剂 | 第36-37页 |
| ·主要实验仪器 | 第37页 |
| ·溶液和培养基 | 第37-38页 |
| ·技术路线 | 第38-39页 |
| ·实验方法 | 第39-46页 |
| ·目的基因的获得 | 第39-43页 |
| ·PCR 引物设计 | 第39-40页 |
| ·质粒pGAP-RML 的抽提 | 第40-41页 |
| ·Rhizomucor miehei Lipase 基因的扩增 | 第41页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第41-42页 |
| ·PCR 产物纯化 | 第42页 |
| ·纯化后的 PCR 产物双酶切 | 第42页 |
| ·酶切后目的产物的凝胶回收 | 第42-43页 |
| ·表达载体pPIC9K-RML 的构建 | 第43-44页 |
| ·质粒pPIC9K 的提取 | 第43页 |
| ·载体pPIC9K 的双酶切及其纯化 | 第43页 |
| ·目的基因 RML 与载体pPIC9K 的体外连接 | 第43-44页 |
| ·重组质粒的获得 | 第44-45页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第44-45页 |
| ·重组质粒pPIC9K-RML 的转化 | 第45页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第45页 |
| ·重组质粒中目的基因序列的测定 | 第45-46页 |
| ·实验结果与分析 | 第46-47页 |
| ·Rhizomucor miehei Lipase 基因的扩增结果 | 第46页 |
| ·重组质粒的构建和双酶切鉴定 | 第46-47页 |
| ·重组质粒的基因序列测定结果 | 第47页 |
| ·小结 | 第47-49页 |
| 第三章 米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第49-65页 |
| ·引言 | 第49页 |
| ·实验材料与仪器 | 第49-52页 |
| ·菌种和质粒 | 第49页 |
| ·主要生化试剂 | 第49-50页 |
| ·主要实验仪器 | 第50页 |
| ·溶液和培养基 | 第50-52页 |
| ·实验方法 | 第52-60页 |
| ·毕赤酵母重组表达载体的构建 | 第52-53页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第53页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备及转化 | 第53-54页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第53-54页 |
| ·毕赤酵母的转化 | 第54页 |
| ·重组子的筛选 | 第54-55页 |
| ·His~+Mut~+阳性克隆的筛选 | 第54-55页 |
| ·三丁酸甘油酯平板活性筛选高表达转化子 | 第55页 |
| ·G418 筛选高拷贝转化子 | 第55页 |
| ·三丁酸甘油酯平板活性筛选高表达转化子 | 第55页 |
| ·甲醇诱导脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第55-56页 |
| ·表达产物的 SDS-PAGE 电泳检测 | 第56-57页 |
| ·表达产物酶活的测定 | 第57-60页 |
| ·橄榄油乳化法 | 第57-59页 |
| ·对硝基苯酚比色法(p-NPL 法)测定脂肪酶活性[80] | 第59-60页 |
| ·实验结果与分析 | 第60-63页 |
| ·酵母重组子的筛选 | 第60-63页 |
| ·初步发酵实验 | 第63页 |
| ·小结与讨论 | 第63-65页 |
| ·小结 | 第63-64页 |
| ·讨论 | 第64-65页 |
| 第四章 毕赤酵母重组菌发酵条件的优化 | 第65-71页 |
| ·引言 | 第65页 |
| ·实验材料与仪器 | 第65-66页 |
| ·实验菌株 | 第65-66页 |
| ·主要生化试剂 | 第66页 |
| ·主要实验仪器 | 第66页 |
| ·培养基 | 第66页 |
| ·实验方法 | 第66页 |
| ·重组菌生长曲线和pH 值曲线的测定 | 第66页 |
| ·重组菌发酵条件的优化 | 第66页 |
| ·酶活测定 | 第66页 |
| ·实验结果与分析 | 第66-69页 |
| ·碳源对重组毕赤酵母发酵生产RML 的影响 | 第66-67页 |
| ·氮源对重组毕赤酵母发酵生产RML 的影响 | 第67-68页 |
| ·诱导温度对毕赤酵母发酵表达RML 的影响 | 第68-69页 |
| ·甲醇浓度对重组毕赤酵母发酵表达RML 的影响 | 第69页 |
| · | 第69-71页 |
| ·小结 | 第69页 |
| ·讨论 | 第69-71页 |
| 第五章 米黑根毛霉脂肪酶酶学性质的初步研究 | 第71-81页 |
| ·引言 | 第71页 |
| ·实验材料与仪器 | 第71-72页 |
| ·实验菌株 | 第71页 |
| ·主要生化试剂 | 第71页 |
| ·主要实验仪器 | 第71页 |
| ·主要溶液 | 第71-72页 |
| ·实验方法 | 第72-74页 |
| ·脂肪酶的酶活测定方法——对硝基苯酚比色法(p-NP 法) | 第72页 |
| ·对硝基苯酚标准曲线的制备 | 第72页 |
| ·脂肪酶活力的测定 | 第72页 |
| ·酶学性质研究 | 第72-74页 |
| ·酶作用最适pH | 第72页 |
| ·酶的pH 稳定性 | 第72-73页 |
| ·酶作用最适温度 | 第73页 |
| ·酶的热稳定性 | 第73页 |
| ·金属离子对酶活性的影响 | 第73页 |
| ·酶的底物特异性 | 第73-74页 |
| ·实验结果与分析 | 第74-79页 |
| ·对硝基苯酚标准曲线的绘制 | 第74页 |
| ·RML 粗酶的酶学性质 | 第74-79页 |
| ·RML 的最适pH 值和pH 值稳定性 | 第74-76页 |
| ·RML 的最适温度和热稳定性 | 第76-78页 |
| ·金属离子对酶活的影响 | 第78页 |
| ·RML 的底物特异性 | 第78-79页 |
| ·小结与讨论 | 第79-81页 |
| ·小结 | 第79-80页 |
| ·讨论 | 第80-81页 |
| 结论与展望 | 第81-83页 |
| 结论 | 第81-82页 |
| 展望 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-91页 |
| 攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 附录 重组质粒 pPIC9K-RML 的 RML 测序结果 | 第93-96页 |
| 答辩委员会对论文的评定意见 | 第96页 |
