| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-17页 |
| 1.1 N-乙酰神经氨酸 | 第10-11页 |
| 1.1.1 Neu5Ac的概述 | 第10页 |
| 1.1.2 Neu5Ac的生物学功能和应用 | 第10-11页 |
| 1.2 Neu5Ac的制备 | 第11-14页 |
| 1.2.1 从天然材料中提取Neu5Ac | 第11页 |
| 1.2.2 化学法合成Neu5Ac | 第11页 |
| 1.2.3 微生物发酵制备Neu5Ac | 第11-12页 |
| 1.2.4 酶法合成Neu5Ac | 第12页 |
| 1.2.5 全细胞催化法合成Neu5Ac | 第12-14页 |
| 1.3 多酶的共表达 | 第14-15页 |
| 1.4 基于Red和FLP重组系统的大肠杆菌基因敲除 | 第15-16页 |
| 1.5 点饱和突变技术及其在蛋白质工程中的应用 | 第16页 |
| 1.6 立题意义与研究内容 | 第16-17页 |
| 第二章 材料与方法 | 第17-25页 |
| 2.1 材料 | 第17-19页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第17页 |
| 2.1.2 引物 | 第17-18页 |
| 2.1.3 酶和试剂 | 第18页 |
| 2.1.4 培养基和培养条件 | 第18页 |
| 2.1.5 仪器设备 | 第18-19页 |
| 2.2 方法 | 第19-25页 |
| 2.2.1 目的基因的扩增 | 第19页 |
| 2.2.2 细菌基因组DNA的提取 | 第19页 |
| 2.2.3 质粒的构建 | 第19页 |
| 2.2.4 制备大肠杆菌感受态细胞 | 第19-20页 |
| 2.2.5 重组质粒转化入大肠杆菌感受态细胞 | 第20页 |
| 2.2.6 重组蛋白的诱导表达 | 第20页 |
| 2.2.7 SDS-PAGE检测重组表达蛋白 | 第20页 |
| 2.2.8 重组蛋白纯化 | 第20-21页 |
| 2.2.9 蛋白浓度检测 | 第21页 |
| 2.2.10 酶活力的测定 | 第21页 |
| 2.2.11 全细胞催化制备Neu5Ac | 第21-22页 |
| 2.2.12 全细胞催化制备Neu5Ac的条件优化 | 第22页 |
| 2.2.13 高效液相色谱HPLC分析 | 第22页 |
| 2.2.14 电转化法敲除大肠杆菌nan T/nag E基因 | 第22-23页 |
| 2.2.15 AGE的饱和突变 | 第23-24页 |
| 2.2.16 AGE动力学测定 | 第24页 |
| 2.2.17 Neu5Ac的分离纯化 | 第24-25页 |
| 第三章 结果与分析 | 第25-44页 |
| 3.1 双细胞偶联催化合成Neu5Ac | 第25-28页 |
| 3.1.1 重组质粒p ET28a-slr和p ET28a-nan A的构建 | 第25-26页 |
| 3.1.2 重组蛋白的诱导表达及酶活测定 | 第26页 |
| 3.1.3 偶联双细胞催化合成Neu5Ac | 第26-27页 |
| 3.1.4 双细胞偶联催化产Neu5Ac的条件优化 | 第27-28页 |
| 3.2 E. coli BL21(DE3)的nag E/nan T基因敲除和其对全细胞生物催化的影响 | 第28-31页 |
| 3.2.1 E. coli BL21(DE3)的nan T基因敲除 | 第28-29页 |
| 3.2.2 E. coli BL21(DE3)的nag E基因敲除 | 第29-30页 |
| 3.2.3 同时敲除E. coli BL21(DE3)的nan T基因和nag E基因 | 第30页 |
| 3.2.4 敲除nag E和nan T基因对全细胞生物催化的影响 | 第30-31页 |
| 3.3 双酶偶联催化合成Neu5Ac | 第31-36页 |
| 3.3.1 双酶偶联表达载体的构建 | 第31-34页 |
| 3.3.2 重组蛋白的诱导表达及酶活测定 | 第34-35页 |
| 3.3.3 双酶偶联细胞催化产Neu5Ac的条件优化 | 第35-36页 |
| 3.4 挖掘新型Nan A基因提高Neu5Ac合成效率 | 第36-40页 |
| 3.4.1 重组质粒p ET28a-(T7-shnal)-(tac-slr)的构建 | 第36-37页 |
| 3.4.2 重组蛋白的诱导表达及酶活测定 | 第37-38页 |
| 3.4.3 全细胞催化合成Neu5Ac | 第38页 |
| 3.4.4 重组菌催化产Neu5Ac的条件优化 | 第38-39页 |
| 3.4.5 敲除nag E和nan T基因对全细胞生物催化的影响 | 第39-40页 |
| 3.5 AGE饱和突变对全细胞催化合成Neu5Ac的影响 | 第40-42页 |
| 3.5.1 AGE的饱和突变 | 第40-41页 |
| 3.5.2 突变株的酶活检测和纯化 | 第41页 |
| 3.5.3 野生型和突变株的动力学参数测定 | 第41-42页 |
| 3.5.4 AGE饱和突变对全细胞催化合成Neu5Ac | 第42页 |
| 3.6 Neu5Ac的分离纯化 | 第42-44页 |
| 主要结论与展望 | 第44-46页 |
| 主要结论 | 第44-45页 |
| 展望 | 第45-46页 |
| 致谢 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-51页 |
| 附录A | 第51-52页 |
| 一、作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第51页 |
| 二、作者其他论文或科研成果 | 第51-52页 |
| 附录B：基因核苷酸序列 | 第52页 |
| 1. 基因slr核苷酸序列 | 第52页 |
| 2. 基因nan A核苷酸序列 | 第52页 |
| 3. 基因shnal核苷酸序列 | 第52页 |
