| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 缩略词表 | 第13-14页 |
| 第一部分 实验研究 | 第14-64页 |
| 第一章 小鼠毛囊特异性表达载体的构建 | 第14-44页 |
| 1. 材料 | 第14-16页 |
| ·主要仪器设备 | 第14页 |
| ·实验试剂与耗材 | 第14-15页 |
| ·菌种和质粒 | 第15页 |
| ·组织材料 | 第15页 |
| ·基因合成与测序 | 第15页 |
| ·溶液配制 | 第15-16页 |
| 2. 方法 | 第16-22页 |
| ·实验方法 | 第16-19页 |
| ·小鼠肝脏基因组的提取 | 第16-17页 |
| ·PCR引物的设计和PCR反应条件 | 第17-18页 |
| ·PCR产物回收 | 第18页 |
| ·感受态细胞制备 | 第18页 |
| ·PCR产物的浓缩 | 第18-19页 |
| ·PCR片段与载体的连接及连接产物的转化 | 第19页 |
| ·重组质粒的提取 | 第19页 |
| ·打靶载体的构建 | 第19-22页 |
| ·MCS的连接与打靶载体骨架的构建 | 第19-20页 |
| ·小鼠同源短臂的分子克隆、测序和与pDs-M的连接及鉴定 | 第20页 |
| ·小鼠K14启动子的分子克隆、测序和与pDs-MS的连接及鉴定 | 第20-21页 |
| ·负筛选标记HSV-TK基因的分子克隆、测序和与pDs-MSK的连接及鉴定 | 第21页 |
| ·小鼠同源长臂的分子克隆、测序和与pDs-MSKT的连接及鉴定 | 第21-22页 |
| ·小鼠noggin目的基因的合成与测序 | 第22页 |
| ·人源K14启动子的克隆、测序与pDs-MSKTLN的连接及鉴定 | 第22页 |
| ·毛囊特异性定点整合打靶载体pDs-MSKTLNE的酶切鉴定 | 第22页 |
| 3. 结果 | 第22-32页 |
| ·MCS的连接与打靶载体骨架的构 | 第22-24页 |
| ·小鼠同源短臂的分子克隆、测序和与pDs-M的连接及鉴定 | 第24-26页 |
| ·小鼠K14启动子的分子克隆、测序和与pDs-MS的连接及鉴定 | 第26-27页 |
| ·负筛选标记HSV-TK基因的分子克隆、测序和与pDs-MSK的连接及鉴定 | 第27-28页 |
| ·小鼠同源长臂的分子克隆、测序和与pDs-MSKT的连接及鉴定 | 第28-30页 |
| ·小鼠Noggin基因的克隆与测序 | 第30页 |
| ·人源角蛋白K14启动子的克隆、测序及连接 | 第30-31页 |
| ·毛囊特异性定点整合打靶载体pDs-MSKTLNE的酶切鉴定 | 第31-32页 |
| 4. 讨论 | 第32-33页 |
| 参考文献 | 第33-35页 |
| 附图1：载体构建流程图 | 第35-38页 |
| 附图2：载体构建过程测序结果的比对 | 第38-44页 |
| 第二章 小鼠胚胎成纤维细胞和成肌细胞的制备及转染 | 第44-64页 |
| 1. 材料 | 第44-45页 |
| ·主要仪器设备 | 第44-45页 |
| ·活体材料 | 第45页 |
| ·主要试剂和耗材 | 第45页 |
| 2 方法 | 第45-50页 |
| ·小鼠胚胎成纤维细胞的制备 | 第45-47页 |
| ·小鼠原代胚胎成纤维细胞(PMEFs)的分离培养 | 第45-46页 |
| ·MEF细胞的冷冻保存 | 第46页 |
| ·MEF细胞的解冻复苏培养 | 第46-47页 |
| ·MEF细胞的传代 | 第47页 |
| ·MEF细胞生长曲线的测定 | 第47页 |
| ·MEF细胞对G418抗药性的检测 | 第47页 |
| ·小鼠成肌细胞C2C12的制备 | 第47-48页 |
| ·C2C12的获得 | 第47页 |
| ·C2C12冷冻保存 | 第47-48页 |
| ·C2C12细胞的解冻复苏培养 | 第48页 |
| ·C2C12细胞的传代 | 第48页 |
| ·C2C12细胞生长曲线的测定 | 第48页 |
| ·C2C12细胞对G418抗药性的检测 | 第48页 |
| ·基因敲除打靶载体转染成纤维细胞和C2C12 | 第48-50页 |
| ·基因敲除打靶载体的纯化与线性化 | 第48页 |
| ·单克隆细胞的筛选 | 第48-49页 |
| ·单克隆细胞的挑取与扩大培养 | 第49页 |
| ·打靶细胞克隆的鉴定 | 第49-50页 |
| 3. 结果 | 第50-60页 |
| ·MEF细胞的分离培养与转染,筛选 | 第50-52页 |
| ·分离培养成纤维细胞的形态学观察 | 第50-51页 |
| ·成纤维细胞生长曲线的测定 | 第51-52页 |
| ·成纤维细胞对G418抗药性的检测 | 第52页 |
| ·C2C12细胞的培养,转染与筛选 | 第52-54页 |
| ·C2C12细胞的形态学观察 | 第52-53页 |
| ·C2C12细胞生长曲线的测定 | 第53页 |
| ·C2C12细胞对G418抗药性的检测 | 第53-54页 |
| ·基因敲除打靶载体pDs-MSKTLNE的纯化与线性化 | 第54-55页 |
| ·细胞的转染、筛选及单克隆细胞的扩大培养 | 第55-59页 |
| ·MEF细胞的转染、筛选及单克隆细胞的扩大培养 | 第56-57页 |
| ·C2C12细胞的转染、筛选及单克隆细胞的扩大培养 | 第57-59页 |
| ·中靶克隆的PCR鉴定与测序分析 | 第59-60页 |
| 4. 讨论 | 第60-61页 |
| 5. 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-64页 |
| 第二部分 文献综述 | 第64-79页 |
| 第一章 哺乳动物基因打靶技术的研究进展 | 第64-70页 |
| 1.基因打鞭技术的方法 | 第64-65页 |
| 2.基因打鞭主要技术环节 | 第65-67页 |
| 3.打鞭载体技术的应用前景 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-70页 |
| 第二章 Noggin基因结构及功能作用的研究进展 | 第70-79页 |
| —、Noggin与其拮抗物BMPs和神经诱导的关系 | 第71-72页 |
| 二、Noggin和其拮抗物BMPs与毛囊发育的关系 | 第72页 |
| 三、Noggin和其拮抗物BMPs与成骨细胞的关系 | 第72-73页 |
| 四、Noggin和其拮抗物BMPs与疾病的关系 | 第73-74页 |
| 五、Noggin基因的应用前景 | 第74页 |
| 参考文献 | 第74-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 攻读硕士学位期间已发表的学术论文 | 第80页 |
