| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 绪论 | 第17-29页 |
| 1.1 CRISPR系统概述 | 第17-23页 |
| 1.1.1 CRISPR系统简介 | 第17-18页 |
| 1.1.2 CRISPR系统组成与分类 | 第18-19页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas9系统作为基因编辑工具 | 第19-21页 |
| 1.1.4 CRSIPR/Cas9系统在微生物中的应用 | 第21页 |
| 1.1.5 CRISPRi系统简介 | 第21-22页 |
| 1.1.6 CRISPRi系统的应用 | 第22页 |
| 1.1.7 sgRNA设计及特异性 | 第22-23页 |
| 1.2 肺炎克雷伯氏菌概况 | 第23-26页 |
| 1.2.1 Klebsiella pneumoniae简介 | 第23-24页 |
| 1.2.2 K.pneumoniae的代谢工程改造 | 第24页 |
| 1.2.3 利用K. pneumoniae及其他微生物生产3-HP | 第24-25页 |
| 1.2.4 乳酸代谢网络概览及K. pneumoniae中的乳酸相关基因 | 第25-26页 |
| 1.3 本课题研究意义 | 第26-29页 |
| 第二章 Cas9在肺炎克雷伯氏菌中的表达与功能验证 | 第29-47页 |
| 2.1 引言 | 第29页 |
| 2.2 实验材料 | 第29-31页 |
| 2.2.1 菌种、质粒及引物 | 第29-31页 |
| 2.2.2 仪器与试剂 | 第31页 |
| 2.2.3 培养基 | 第31页 |
| 2.3 实验方法 | 第31-39页 |
| 2.3.1 菌种保藏 | 第31页 |
| 2.3.2 培养条件 | 第31-32页 |
| 2.3.3 pCL质粒的构建 | 第32-37页 |
| 2.3.4 pCL(del)质粒的构建 | 第37页 |
| 2.3.5 sgRNA靶标序列的设计 | 第37页 |
| 2.3.6 plac-sgRNA1及plac-sgRNA2质粒的构建 | 第37页 |
| 2.3.7 pSg1及pSg2的构建 | 第37-38页 |
| 2.3.8 K. pneumoniae中质粒切割系统的构建 | 第38页 |
| 2.3.9 K. peumoniae中CRISPR/Cas9介导的质粒切割 | 第38-39页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第39-46页 |
| 2.4.1 pCL质粒的构建 | 第39-40页 |
| 2.4.2 pCL(del)质粒的构建 | 第40-41页 |
| 2.4.3 sgRNA靶标序列的设计 | 第41页 |
| 2.4.4 质粒plac-sgRNA1、plac-sgRNA2的构建 | 第41-42页 |
| 2.4.5 质粒pSg1和pSg2的构建 | 第42-43页 |
| 2.4.6 克雷伯菌中质粒切割系统的构建 | 第43-44页 |
| 2.4.7 克雷伯菌中CRISPR/Cas9介导的质粒切割实验 | 第44-46页 |
| 2.5 本章小结 | 第46-47页 |
| 第三章 CRISPRi系统在肺炎克雷伯氏菌中对基因表达抑制的研究 | 第47-57页 |
| 3.1 引言 | 第47页 |
| 3.2 实验材料 | 第47-49页 |
| 3.2.1 菌种、质粒及引物 | 第47-48页 |
| 3.2.2 仪器与试剂 | 第48页 |
| 3.2.3 培养基 | 第48-49页 |
| 3.3 实验方法 | 第49-51页 |
| 3.3.1 菌种保藏 | 第49页 |
| 3.3.2 培养条件 | 第49页 |
| 3.3.3 ptac-egfp质粒的构建 | 第49-50页 |
| 3.3.4 ptaci质粒的构建 | 第50页 |
| 3.3.5 Kp(EB)、Kp (ET_1)、Kp (ET_2)的构建 | 第50页 |
| 3.3.6 荧光强度检测 | 第50-51页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第51-56页 |
| 3.4.1 ptac-egfp质粒的构建 | 第51-52页 |
| 3.4.2 ptaci系列质粒的构建 | 第52页 |
| 3.4.3 Kp (EB)、Kp (ET_1)、Kp(ET_2)菌株的构建 | 第52-54页 |
| 3.4.4 肺炎克雷伯氏菌中CRISPRi系统抑制基因表达的验证 | 第54-56页 |
| 3.5 本章小结 | 第56-57页 |
| 第四章 利用CRISPRi系统探究降低高产3-HP肺炎克雷伯氏菌乳酸合成的方法 | 第57-79页 |
| 4.1 引言 | 第57页 |
| 4.2 实验材料 | 第57-59页 |
| 4.2.1 菌种、质粒及引物 | 第57-59页 |
| 4.2.2 仪器与试剂 | 第59页 |
| 4.2.3 培养基 | 第59页 |
| 4.3 实验方法 | 第59-62页 |
| 4.3.1 placi系列质粒的构建 | 第59页 |
| 4.3.2 含有CRISPRi系统的高产3-HP肺炎克雷伯氏菌的构建 | 第59-60页 |
| 4.3.3 placiMALD质粒的构建 | 第60页 |
| 4.3.4 Kp(ptac-puuC+placiMALD)菌株的构建 | 第60页 |
| 4.3.5 RT-qPCR实验 | 第60页 |
| 4.3.6 摇瓶发酵实验 | 第60-61页 |
| 4.3.7 5 L发酵罐上罐发酵 | 第61-62页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第62-78页 |
| 4.4.1 placi系列质粒的构建 | 第62-63页 |
| 4.4.2 含有CRISPRi系统的高产3-HP肺炎克雷伯氏菌的构建 | 第63-67页 |
| 4.4.3 RT-qPCR实验 | 第67-70页 |
| 4.4.5 placiMALD质粒的构建 | 第70-72页 |
| 4.4.6 Kp(ptac-puuC+placiMALD)菌株的构建 | 第72-73页 |
| 4.4.7 摇瓶发酵实验 | 第73-75页 |
| 4.4.8 5 L发酵罐上罐发酵 | 第75-78页 |
| 4.5 本章小结 | 第78-79页 |
| 第五章 总结与建议 | 第79-81页 |
| 5.1 结论 | 第79页 |
| 5.2 创新点 | 第79-80页 |
| 5.3 问题与建议 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-85页 |
| 附录1 试剂 | 第85-87页 |
| 附录2 仪器设备 | 第87-89页 |
| 致谢 | 第89-91页 |
| 作者和导师简介 | 第91-93页 |
| 附件 | 第93-94页 |
