| 目录 | 第1-11页 |
| 摘要 | 第11-13页 |
| Abstract | 第13-16页 |
| 论文创新点 | 第16-17页 |
| 前言 | 第17-19页 |
| 第一部分 文献综述 | 第19-40页 |
| 第一章 猪圆环病毒病 | 第19-32页 |
| 1. PCVD的病原学特征 | 第19-25页 |
| ·PCV的发现 | 第19-20页 |
| ·PCV的形态学和理化特性 | 第20页 |
| ·PCV的分类地位 | 第20页 |
| ·PCV基因组与复制、转录 | 第20-22页 |
| ·PCV编码产物的功能 | 第22-25页 |
| ·Rep和Rep’蛋白 | 第22-23页 |
| ·Cap蛋白 | 第23-25页 |
| ·ORF3与其它ORF | 第25页 |
| 2. PCVD的实验室诊断 | 第25-29页 |
| ·病毒分离 | 第25-26页 |
| ·PCR | 第26-27页 |
| ·原位杂交 | 第27-28页 |
| ·免疫组化 | 第28页 |
| ·IFA/IPMA | 第28页 |
| ·ELISA | 第28-29页 |
| 3. PCVD的疫苗研究 | 第29-32页 |
| ·PCV2诱导的免疫反应 | 第29-30页 |
| ·PCV2疫苗的研究 | 第30-32页 |
| 第二章 病毒蛋白抗原表位分析与应用 | 第32-40页 |
| 1. 抗原表位的种类 | 第32-33页 |
| 2. 抗原表位分析方法 | 第33-38页 |
| ·B细胞抗原表位分析方法 | 第33-36页 |
| ·传统化学"切割"法或酶法 | 第33页 |
| ·生物物理方法 | 第33-34页 |
| ·表位理论预测法 | 第34-35页 |
| ·重叠多肽扫描技术 | 第35页 |
| ·噬菌体表面展示肽库技术 | 第35-36页 |
| ·T细胞抗原表位分析方法 | 第36-38页 |
| ·基于重叠多肽的T细胞表位分析 | 第36-37页 |
| ·T细胞表位理论预测 | 第37-38页 |
| 3. 抗原表位分析与表位疫苗 | 第38-40页 |
| 第二部分 研究内容 | 第40-117页 |
| 第一章 猪圆环病毒衣壳蛋白的重组表达 | 第40-53页 |
| 摘要 | 第40-41页 |
| 1. 材料 | 第41页 |
| 2. 方法 | 第41-46页 |
| ·pGEX-PCV2-dCap和pET-PCV1-dCap原核表达载体的构建 | 第41-42页 |
| ·PCV2 GST-dCap和PCV1 His-dCap融合蛋白的诱导表达 | 第42页 |
| ·SDS-PAGE与Western blot鉴定 | 第42-43页 |
| ·表达条件优化 | 第43页 |
| ·大量表达与纯化 | 第43-44页 |
| ·蛋白含量测定 | 第44-46页 |
| 3. 结果 | 第46-49页 |
| ·pGEX-PCV2-dCap和pET-PCV1-dCap原核表达载体的构建 | 第46页 |
| ·PCV重组Cap蛋白的表达与鉴定 | 第46-48页 |
| ·表达条件优化与大量纯化 | 第48-49页 |
| 4. 讨论 | 第49-53页 |
| 第二章 猪圆环病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 | 第53-76页 |
| 摘要 | 第53-54页 |
| 1. 材料 | 第54页 |
| 2. 方法 | 第54-58页 |
| ·PCV重组Cap抗原的制备 | 第54页 |
| ·PCV2病毒抗原的制备 | 第54页 |
| ·动物免疫 | 第54页 |
| ·杂交瘤细胞株的建立、筛选及腹水制备 | 第54-55页 |
| ·间接ELISA | 第55页 |
| ·间接免疫荧光试验(IFA) | 第55-56页 |
| ·单抗效价与亚类鉴定 | 第56页 |
| ·与PCV2重组GST-dCap、PCV1 His-dCap蛋白的反应性 | 第56页 |
| ·与PCV2、PCV1感染细胞的反应性 | 第56页 |
| ·与真核表达的PCV2 Cap蛋白和PCV1 Cap蛋白的反应性 | 第56-58页 |
| ·pCI-PCV2-Cap和pCI-PCV1-Cap真核表达载体的构建 | 第56-57页 |
| ·转染级超纯真核表达质粒的提取 | 第57页 |
| ·脂质体介导转染 | 第57-58页 |
| ·单克隆抗体的中和活性测定 | 第58页 |
| 3. 结果 | 第58-71页 |
| ·PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 | 第58-59页 |
| ·PCV1重组His-dCap蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 | 第59页 |
| ·单克隆抗体与PCV2、PCV1病毒的反应性 | 第59-65页 |
| ·单克隆抗体与真核表达的PCV Cap蛋白的反应性 | 第65-70页 |
| ·单克隆抗体的中和活性测定 | 第70-71页 |
| 4. 讨论 | 第71-76页 |
| 第三章 猪圆环病毒2型衣壳蛋白线性B细胞抗原表位的精细定位 | 第76-100页 |
| 摘要 | 第76-77页 |
| 1. 材料 | 第77页 |
| ·试剂与仪器 | 第77页 |
| ·单克隆抗体和多克隆抗体 | 第77页 |
| 2. 方法 | 第77-83页 |
| ·多肽的设计与合成 | 第77-81页 |
| ·多肽溶解与保存 | 第81页 |
| ·多肽偶联 | 第81-82页 |
| ·试验设计 | 第82页 |
| ·Peptide-ELISA | 第82页 |
| ·Peptide-dot-ELISA | 第82页 |
| ·多肽免疫实验 | 第82-83页 |
| ·PCV2血清学标志的初步评估 | 第83页 |
| 3. 结果 | 第83-95页 |
| ·PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的抗原表位定位 | 第83页 |
| ·位脯氨酸(~(233)Pro)是PCV2 Cap蛋白的特异、关键氨基酸 | 第83-84页 |
| ·PCV2 Cap蛋白的抗原表位谱 | 第84-85页 |
| ·氨基酸位231-233、175-192、155-162、115-132是PCV2 Cap蛋白的免疫优势表位 | 第85-95页 |
| ·表位231-233是PCV2 Cap蛋白潜在的血清学标志 | 第95页 |
| 4. 讨论 | 第95-100页 |
| 第四章 猪圆环病毒2型Cap蛋白抗体间接ELISA检测技术的建立 | 第100-117页 |
| 摘要 | 第100-101页 |
| 1. 材料 | 第101页 |
| ·试剂与仪器 | 第101页 |
| ·血清与实验动物 | 第101页 |
| 2. 方法 | 第101-105页 |
| ·抗原制备 | 第101页 |
| ·PCV2和PCV2 Cap猪阳性血清的制备 | 第101-102页 |
| ·IFA筛选临床血清 | 第102页 |
| ·ELISA操作基本程序 | 第102页 |
| ·ELISA反应体系的建立 | 第102-103页 |
| ·抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定 | 第102页 |
| ·酶标记抗体的工作浓度的确定 | 第102-103页 |
| ·包被液的选择 | 第103页 |
| ·封闭液的选择 | 第103页 |
| ·样品稀释液的选择 | 第103页 |
| ·血清最佳反应时间的确定 | 第103页 |
| ·酶标抗体反应时间的确定 | 第103页 |
| ·TMB底物反应时间的确定 | 第103页 |
| ·间接ELISA判定标准的确定 | 第103-104页 |
| ·重复性检验 | 第104页 |
| ·批内重复性试验 | 第104页 |
| ·批间重复性试验 | 第104页 |
| ·特异性试验 | 第104页 |
| ·有效性试验 | 第104-105页 |
| ·与IFA的比较 | 第104页 |
| ·与PCV2全病毒ELISA的比较 | 第104-105页 |
| ·与PCV2特异的Peptide ELISA的比较 | 第105页 |
| ·与进口ELISA试剂盒的比较 | 第105页 |
| ·PCV2人工感染猪的抗体产生规律 | 第105页 |
| 3. 结果 | 第105-113页 |
| ·临床血清IFA检测结果 | 第105-106页 |
| ·间接ELISA最佳工作条件的确定 | 第106-107页 |
| ·抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定 | 第106页 |
| ·酶标二抗的工作浓度和包被液的确定 | 第106-107页 |
| ·封闭液与稀释液的确定 | 第107页 |
| ·血清最佳反应时间与酶标抗体反应时间的确定 | 第107页 |
| ·TMB底物反应时间的确定 | 第107页 |
| ·ELISA判定标准 | 第107-109页 |
| ·重复性 | 第109页 |
| ·ELISA方法的特异性 | 第109-110页 |
| ·与IFA、PCV2全病毒ELISA的比较 | 第110-111页 |
| ·与PCV2特异的Peptide ELISA和进口INGEZIM PCV2试剂盒的比较 | 第111-112页 |
| ·人工感染PCV2病毒后的抗体变化 | 第112-113页 |
| 4. 讨论 | 第113-117页 |
| 全文总结 | 第117-118页 |
| 参考文献 | 第118-126页 |
| 常用缓冲液及培养基配方 | 第126-137页 |
| 攻博期间发表或录用的学术论文 | 第137-138页 |
| 致谢 | 第138页 |
