| 原创性声明 | 第1页 |
| 学位论文版权使用授权书 | 第3-10页 |
| 摘要 | 第10-13页 |
| ABSTRACT | 第13-18页 |
| 前言 | 第18-20页 |
| 上篇 文献综述 | 第20-70页 |
| 第一章 根结线虫与寄主互作的研究进展 | 第21-33页 |
| 1 根结线虫几个主要的分泌器官 | 第21-22页 |
| ·头感器和侧尾腺 | 第21页 |
| ·排泄系统和直肠 | 第21-22页 |
| ·表皮 | 第22页 |
| ·侧器 | 第22页 |
| ·食道腺 | 第22页 |
| 2 几种主要线虫分泌的蛋白 | 第22-32页 |
| ·14-3-3蛋白 | 第22-26页 |
| ·β-1，4-内切葡聚糖酶 | 第26-27页 |
| ·蛋白酶 | 第27页 |
| ·分支酸变位酶 | 第27-28页 |
| ·钙网蛋白 | 第28-29页 |
| ·乙酰胆碱酯酶 | 第29页 |
| ·泛素延展蛋白 | 第29-30页 |
| ·毒性或无毒蛋白 | 第30-32页 |
| 3 小结 | 第32-33页 |
| 第二章 根结线虫与寄主互作的研究技术和方法 | 第33-48页 |
| 1 毒性和无毒近等基因系 | 第33页 |
| 2 根结线虫和寄主互作研究中常用的方法和技术 | 第33-38页 |
| ·蛋白质组学直接分析线虫口针分泌物 | 第33-34页 |
| ·候选基因策略 | 第34页 |
| ·构建食道腺细胞特异性cDNA文库 | 第34页 |
| ·差异显示方法 | 第34-38页 |
| ·扩增片段长度多态性 | 第34-35页 |
| ·抑制差减杂交 | 第35-37页 |
| ·代表性差异分析 | 第37-38页 |
| 3 得到基因全长的主要方法 | 第38-42页 |
| ·构建基因组文库或cDNA文库 | 第38-39页 |
| ·反向PCR | 第39页 |
| ·cDNA末端快速扩增 | 第39-42页 |
| 4 研究植物病原线虫致病基因功能的方法 | 第42-48页 |
| ·RNA干涉(RNA Interference，RNAi) | 第42-47页 |
| ·RNAi的发现 | 第42-43页 |
| ·线虫中RNAi的机制 | 第43-45页 |
| ·RNAi技术在防治植物寄生线虫中的潜力 | 第45-46页 |
| ·取食管和dsRNA的摄取 | 第46页 |
| ·RNAi的特异性 | 第46-47页 |
| ·效果及可持续性 | 第47页 |
| ·生物安全性 | 第47页 |
| ·转化植物 | 第47-48页 |
| 第三章 植物抗线虫基因 | 第48-52页 |
| 1 植物抗病基因的分类 | 第48-49页 |
| 2 植物的抗线虫基因 | 第49-51页 |
| ·Hs1~(Pro-1) | 第49-50页 |
| ·Gpa2 | 第50页 |
| ·Mi-1 | 第50-51页 |
| 3 抗线虫基因的抗性机制 | 第51-52页 |
| ·Mi基因的抗性机制 | 第51页 |
| ·其它抗线虫基因的抗性机制 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-70页 |
| 下篇 研究内容 | 第70-157页 |
| 第一章 抑制差减杂交法克隆花生根结线虫致病相关基因 | 第71-93页 |
| 1 材料与方法 | 第74-84页 |
| ·线虫的培养 | 第74页 |
| ·侵染前及侵染后二龄幼虫的分离与收集 | 第74页 |
| ·核酸的提取 | 第74-76页 |
| ·抑制差减杂交 | 第76-80页 |
| ·构建抑制差减杂交cDNA文库 | 第80-81页 |
| ·反向Northern blot初步筛选差异表达的cDNA片段 | 第81-84页 |
| ·RT-PCR进一步筛选差异表达的cDNA片段 | 第84页 |
| 2 结果 | 第84-90页 |
| ·抑制差减杂交效率 | 第84-85页 |
| ·抑制差减杂交cDNA的转化 | 第85页 |
| ·菌落 PCR筛选阳性克隆 | 第85页 |
| ·反向Northern blot初步筛选差异表达的cDNA片段 | 第85-86页 |
| ·RT-PCR进一步筛选差异表达的cDNA片段 | 第86-88页 |
| ·差异表达的cDNA片段的序列分析 | 第88-90页 |
| 3 讨论 | 第90-93页 |
| 第二章 代表性差异分析法克隆花生根结线虫致病相关基因 | 第93-110页 |
| 1 材料与方法 | 第94-102页 |
| ·线虫的培养 | 第94页 |
| ·侵染前及侵染后二龄幼虫的分离与收集 | 第94页 |
| ·核酸的提取 | 第94页 |
| ·RDA | 第94-101页 |
| ·准备Driver-cDNA | 第94-96页 |
| ·第一轮 RDA | 第96-97页 |
| ·DpnII酶切除去J接头 | 第97页 |
| ·第二轮 RDA | 第97-98页 |
| ·DpnII酶切除去N接头 | 第98-99页 |
| ·第三轮 RDA | 第99-100页 |
| ·DpnII酶切除去J接头 | 第100页 |
| ·第四轮 RDA | 第100-101页 |
| ·差异表达的cDNA片段的凝胶回收 | 第101-102页 |
| ·TA克隆连接反应 | 第102页 |
| ·转化 | 第102页 |
| ·转化子PCR筛选 | 第102页 |
| ·RT-PCR进一步筛选及验证差异表达的cDNA片段 | 第102页 |
| 2 结果 | 第102-107页 |
| ·四轮 RDA | 第102-103页 |
| ·菌落 PCR筛选阳性克隆 | 第103页 |
| ·RT-PCR进一步筛选及验证差异表达的cDNA片段 | 第103-105页 |
| ·差异表达的cDNA片段的序列分析 | 第105-107页 |
| 3 讨论 | 第107-110页 |
| 第三章 cDNA末端快速扩增法扩增差异表达基因的全长cDNA | 第110-126页 |
| 1 材料与方法 | 第112-115页 |
| ·引物设计与合成 | 第112页 |
| ·RACE(The SMART~(TM) RACE Amplilfication Kit，Clontech) | 第112-114页 |
| ·克隆目标片段 | 第114页 |
| ·序列分析 | 第114-115页 |
| 2 结果 | 第115-123页 |
| ·3’-RACE | 第115页 |
| ·5’-RACE | 第115-116页 |
| ·序列分析 | 第116-123页 |
| ·cDNA序列拼接 | 第116页 |
| ·cDNA核酸序列分析 | 第116-117页 |
| ·氨基酸序列分析 | 第117-123页 |
| ·对AV-250的氨基酸序列分析 | 第117-118页 |
| ·对AV-550的氨基酸序列分析 | 第118-119页 |
| ·对AV-500的氨基酸序列分析 | 第119-123页 |
| 3 讨论 | 第123-126页 |
| 第四章 花生根结线虫分支酸变位酶cDNA的克隆和分析 | 第126-147页 |
| 1 材料与方法 | 第128-136页 |
| ·根结线虫的培养 | 第128页 |
| ·根结线虫的孵化 | 第128页 |
| ·侵染前及侵染后二龄幼虫的分离与收集 | 第128页 |
| ·mRNA的提取 | 第128页 |
| ·应用cDNA末端快速扩增法克隆分支酸变位酶全长cDNA | 第128-130页 |
| ·克隆目标片段 | 第130-131页 |
| ·分支酸变位酶cDNA序列的生物信息学分析 | 第131页 |
| ·分支酸变位酶的发育表达模式 | 第131页 |
| ·分支酸变位酶的原位杂交分析 | 第131-134页 |
| ·从毒性花生根结线虫群体中克隆分支酸变位酶 | 第134页 |
| ·Virtual Northern分析分支酸变位酶的表达差异 | 第134-136页 |
| 2 结果 | 第136-143页 |
| ·花生根结线虫的分支酸变位酶基因 | 第136-137页 |
| ·分支酸变位酶氨基酸序列的多重序列比对 | 第137-140页 |
| ·分支酸变位酶发育表达模式 | 第140-141页 |
| ·分支酸变位酶的组织定位 | 第141页 |
| ·从毒性花生根结线虫中扩增分支酸变位酶 | 第141-142页 |
| ·Virtual Northern分析分支酸变位酶的表达差异 | 第142-143页 |
| 3 讨论 | 第143-147页 |
| 参考文献 | 第147-157页 |
| 附录一 用不同的RACE方法扩增花生根结线虫的Actin基因5’cDNA末端 | 第157-164页 |
| 1 方法一: SMART~(TM) RACE(Clontech) | 第157页 |
| 2 方法二: RNA ligase-mediated RACE | 第157-159页 |
| ·合成ss cDNA | 第157页 |
| ·消化杂合的RNA | 第157-158页 |
| ·连接GR-5’-Oligo | 第158页 |
| ·RACE | 第158-159页 |
| 3 方法三: Modified from the instrction manual for Roche’s RACE Kit | 第159-162页 |
| ·第一条cDNA链的合成与纯化 | 第159-160页 |
| ·消化杂合的RNA | 第160页 |
| ·加Poly(A)尾 | 第160-161页 |
| ·PCR扩增 | 第161-162页 |
| 4 结果 | 第162-164页 |
| 附录二 各章中用到的引物或寡聚核苷酸序列 | 第164-169页 |
| 攻读博士学位期间发表或已被接受的研究论文 | 第169-170页 |
| 致谢 | 第170页 |
