| 中文摘要 | 第1-7页 |
| 英文摘要 | 第7-11页 |
| 1 引言 | 第11-35页 |
| 1．1 PVX分子生物学研究进展及其作为表达载体的应用 | 第12-21页 |
| 1．2 植物抗病毒基因工程研究进展 | 第21-27页 |
| 1．3 转基因植物中RNA介导的病毒抗性研究进展 | 第27-33页 |
| 1．4 本研究的立论依据和主要研究内容 | 第33-35页 |
| 2 材料与方法 | 第35-53页 |
| 2．1 质粒、菌株、酶和试剂 | 第35页 |
| 2．2 PVX-SD1的分离与鉴定 | 第35-39页 |
| 2．2．1 病毒的分离 | 第35页 |
| 2．2．2 病毒的提纯 | 第35页 |
| 2．2．3 病毒的鉴定 | 第35-39页 |
| 2．2．3．1 电镜观察 | 第35-36页 |
| 2．2．3．2 病毒外壳蛋白组份电泳分析 | 第36-37页 |
| 2．2．3．3 病毒核酸的提取 | 第37-39页 |
| 2．3 PVX-SD1外壳蛋白基因的克隆和序列分析 | 第39-45页 |
| 2．3．1 引物设计 | 第39页 |
| 2．3．2 RT-PCR | 第39-40页 |
| 2．3．3 PCR产物的纯化 | 第40页 |
| 2．3．4 质粒DNA的提取 | 第40-43页 |
| 2．3．5 质粒DNA和扩增的目的片段的酶切 | 第43页 |
| 2．3．6 质粒DNA与目的片段DNA的连接 | 第43页 |
| 2．3．7 感受态细胞的制备 | 第43-44页 |
| 2．3．8 质粒DNA向大肠杆菌中转化（热激法) | 第44页 |
| 2．3．9 转化菌落PCR鉴定 | 第44页 |
| 2．3．10 转化菌落酶切鉴定 | 第44页 |
| 2．3．11 序列分析与基因递交NCBI | 第44-45页 |
| 2．4 PVX抗血清的制备和山东省PVX发生情况的调查 | 第45-48页 |
| 2．4．1 PVX抗血清的制备 | 第45-46页 |
| 2．4．2 抗血清效价测定和特异性测定 | 第46页 |
| 2．4．3 免疫球蛋白（IgG）的制备及工作浓度的测定 | 第46-47页 |
| 2．4．4 酶标记羊抗兔间接法检测病毒 | 第47页 |
| 2．4．5 山东省PVX发生情况的检测 | 第47-48页 |
| 2．5 非翻译CP基因的克隆、植物表达载体的构建及转基因植株的获得 | 第48-53页 |
| 2．5．1 非翻译PVXCP基因的克隆 | 第48页 |
| 2．5．2 植物表达载体的构建 | 第48-50页 |
| 2．5．2．1 植物表达载体的构建策略 | 第48页 |
| 2．5．2．2 目的片段与植物表达载体的连接 | 第48页 |
| 2．5．2．3 质粒向大肠杆菌DH5α的转化 | 第48-50页 |
| 2．5．2．4 重组表达载体向农杆菌中转化（冻融法) | 第50页 |
| 2．5．3 目的基因向烟草中的转化及植株再生 | 第50-51页 |
| 2．5．4 转基因植株的抗病性及ELISA检测 | 第51页 |
| 2．5．5 植物总DNA的提取（CTAB法) | 第51-52页 |
| 2．5．6 转基因植株的PCR检测 | 第52-53页 |
| 3 结果与分析 | 第53-73页 |
| 3．1 PVX-SD1的分离与鉴定 | 第53-54页 |
| 3．1．1 病毒的提纯及其粒体形态 | 第53页 |
| 3．1．2 病毒外壳蛋白亚基分子量的测定 | 第53-54页 |
| 3．1．3 马铃薯X病毒RNA的提取 | 第54页 |
| 3．2 外壳蛋白基因的克隆、序列分析及株系鉴定 | 第54-62页 |
| 3．2．1 cDNA的合成及PCR扩增 | 第55页 |
| 3．2．2 质粒pUC19的酶切电泳 | 第55页 |
| 3．2．3 外源DNA与质粒载体的连接及重组质粒向大肠杆菌中的转化 | 第55-56页 |
| 3．2．4 重组质粒的酶切鉴定 | 第56-57页 |
| 3．2．5 CP基因的核苷酸序列分析 | 第57-58页 |
| 3．2．6 与其他PVX株系CP基因的核苷酸及氨基酸序列比较 | 第58-62页 |
| 3．3 PVX抗血清的制备和山东省PVX发生情况的调查 | 第62-65页 |
| 3．3．1 抗血清的效价 | 第62页 |
| 3．3．2 抗血清特异性测定 | 第62页 |
| 3．3．3 抗血清IgG工作浓度的选择 | 第62-63页 |
| 3．3．4 山东省各地市PVX发生情况的调查 | 第63-65页 |
| 3．4 非翻译PVXCP基因的克隆、植物表达载体的构建及转基因植株的获得 | 第65-73页 |
| 3．4．1 RT-PCR扩增的非翻译CP基因 | 第65页 |
| 3．4．2 基因的克隆与重组质粒的鉴定 | 第65-66页 |
| 3．4．3 基因序列的测定与分析 | 第66-68页 |
| 3．4．4 植物表达载体的构建 | 第68-69页 |
| 3．4．5 烟草遗传转化及转基因植株再生 | 第69-70页 |
| 3．4．6 转基因烟草的抗病性分析 | 第70-73页 |
| 3．4．6．1 转基因植株的抗病表现型及ELISA检测 | 第70-72页 |
| 3．4．6．2 转基因烟草的PCR检测 | 第72-73页 |
| 4 讨论 | 第73-79页 |
| 4．1 关于PVX-SD1外壳蛋白的分子量 | 第73页 |
| 4．2 关于PVX-SD1株系鉴定 | 第73-74页 |
| 4．3 PVX-SD1与HB株系的比较 | 第74-75页 |
| 4．4 关于病毒的提纯及病毒核酸的提取 | 第75-76页 |
| 4．5 间接ELISA检测技术与山东省马铃薯田间PVX带毒率的调查 | 第76页 |
| 4．6 烟草组织培养中遇到的问题及解决办法 | 第76-77页 |
| 4．7 非翻译CP基因转基因植株的获得 | 第77-79页 |
| 5 结论 | 第79-81页 |
| 参考文献 | 第81-90页 |
| 附录 | 第90-99页 |
