| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 第1章 绪论 | 第12-27页 |
| ·课题背景 | 第12-13页 |
| ·谷氨酰胺转胺酶研究概况 | 第13-19页 |
| ·谷氨酰胺转胺酶的催化机理 | 第13-14页 |
| ·谷氨酰胺转胺酶在食品中的应用 | 第14-15页 |
| ·谷氨酰胺转胺酶的来源和性质 | 第15-17页 |
| ·谷氨酰胺转胺酶的生产 | 第17-19页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第19-25页 |
| ·毕赤酵母的表达载体 | 第20页 |
| ·外源基因的转化与整合 | 第20-21页 |
| ·高拷贝转化菌株的筛选 | 第21页 |
| ·外源蛋白的翻译后修饰 | 第21-22页 |
| ·影响外源基因表达的因素及其优化策略 | 第22-24页 |
| ·毕赤酵母表达重组玉米谷氨酰胺转胺酶 | 第24-25页 |
| ·应用前景及局限性 | 第25页 |
| ·本课题主要研究内容 | 第25-27页 |
| 第2章 实验材料与方法 | 第27-45页 |
| ·实验材料 | 第27-31页 |
| ·实验原料 | 第27页 |
| ·宿主菌和载体质粒 | 第27页 |
| ·主要仪器 | 第27-28页 |
| ·试剂盒及酶 | 第28页 |
| ·药品试剂 | 第28页 |
| ·合成引物 | 第28页 |
| ·常用试剂的配制 | 第28-30页 |
| ·培养基的配制 | 第30-31页 |
| ·玉米谷氨酰胺转胺酶基因的克隆 | 第31-37页 |
| ·玉米总RNA 的提取 | 第31-32页 |
| ·RT-PCR 反应 | 第32页 |
| ·PCR 产物的回收 | 第32页 |
| ·PCR 的产物与T-载体的连接 | 第32-33页 |
| ·CaCl_2 法制备大肠杆菌感受态细胞 | 第33页 |
| ·冻存大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第33-34页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第34页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第34页 |
| ·重组质粒pMD18T-TGZ 的鉴定 | 第34-36页 |
| ·玉米TGase 的序列分析 | 第36页 |
| ·重组原核表达载体pLLP-OmpA-TGZ 的构建及其鉴定 | 第36页 |
| ·PCR 扩增TGZ 基因及空载体pLLP-OmpA 的提取 | 第36页 |
| ·TGZ 基因和表达载体pLLP-OmpA 的连接和转化 | 第36-37页 |
| ·重组表达载体pLLP-OmpA -TGZ 的鉴定 | 第37页 |
| ·TGZ 基因在原核表达系统的诱导表达及SDS-PAGE 检测 | 第37-38页 |
| ·TGZ 基因在大肠杆菌(E. coli)Top10F’中的诱导表达 | 第37页 |
| ·重组表达蛋白的SDS-PAGE 电泳分析 | 第37-38页 |
| ·TGZ 基因的毕赤酵母表达载体的构建 | 第38-41页 |
| ·PCR 扩增TGZ 基因及空载体pPIC9K 的提取 | 第38页 |
| ·TGZ 基因和表达载体pPIC9K 的连接和转化 | 第38-39页 |
| ·重组表达载体pPIC9K-TGZ 的鉴定 | 第39页 |
| ·重组表达载体pPIC9K-TGZ 和空载体pPIC9K 的线性化 | 第39页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第39页 |
| ·线性化质粒电击转化毕赤酵母感受态细胞 | 第39-40页 |
| ·甲醇利用表型的确定 | 第40页 |
| ·高拷贝转化子的筛选 | 第40页 |
| ·重组酵母基因组DNA 的提取 | 第40页 |
| ·重组酵母的PCR 检测 | 第40-41页 |
| ·TGZ 基因在毕赤酵母 GS115 中的诱导表达和酶活测定 | 第41-42页 |
| ·酵母转化子的诱导表达 | 第41-42页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE 分析 | 第42页 |
| ·重组玉米TGase 分离纯化及其对酪蛋白的交联作用 | 第42页 |
| ·重组谷氨酰胺转胺酶活性测定 | 第42页 |
| ·重组TG 对酪蛋白的交联作用 | 第42页 |
| ·天然玉米谷氨酰胺转胺酶的分离纯化 | 第42-45页 |
| ·玉米幼苗的培养 | 第42-43页 |
| ·天然玉米谷氨酰胺转胺酶粗酶液的提取 | 第43页 |
| ·硫酸铵分级盐析法纯化玉米TGase | 第43-44页 |
| ·脱盐 | 第44-45页 |
| 第3章 玉米谷氨酰胺转胺酶基因的克隆及序列分析 | 第45-54页 |
| ·玉米谷氨酰胺转氨酶基因的克隆 | 第46页 |
| ·玉米谷氨酰胺转胺酶基因TGZ 扩增产物的鉴定 | 第46-47页 |
| ·PCR 产物与pMD-18T 载体的连接 | 第47页 |
| ·重组载体pMD18-T-TGZ 的PCR 鉴定 | 第47页 |
| ·重组载体pMD18-T-TGZ 的酶切鉴定 | 第47-48页 |
| ·重组克隆载体的测序鉴定 | 第48页 |
| ·玉米TGZ 基因的序列分析 | 第48-52页 |
| ·玉米TGase 的氨基酸序列分析 | 第48-50页 |
| ·玉米TGase 的Motif 识别 | 第50-51页 |
| ·TGase 亲/疏水性分析二级结构预测 | 第51-52页 |
| ·讨论 | 第52-53页 |
| ·本章小结 | 第53-54页 |
| 第4章 玉米谷氨酰胺转胺酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第54-61页 |
| ·重组原核表达载体pLLP-OmpA-TGZ 的构建 | 第54-57页 |
| ·组载体pLLP-OmpA-TGZ 的PCR 鉴定 | 第55-56页 |
| ·重组载体pLLP-OmpA-TGZ 的双酶切鉴定 | 第56-57页 |
| ·重组表达载体pLLP-OmpA-TGZ 的序列测定 | 第57页 |
| ·重组菌株Top10F’-TGZ 的诱导表达 | 第57页 |
| ·讨论 | 第57-59页 |
| ·宿主的选择 | 第58页 |
| ·折叠机制 | 第58-59页 |
| ·本章小结 | 第59-61页 |
| 第5章 玉米谷氨酰胺转胺酶基因在毕赤酵母中的重组表达 | 第61-70页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第61-63页 |
| ·重组酵母表达载体的PCR 鉴定 | 第61-62页 |
| ·重组酵母表达载体的双酶切鉴定 | 第62-63页 |
| ·重组酵母表达载体pPIC9K-TGZ 的测序鉴定 | 第63页 |
| ·酵母表达载体 pPIC9K-TGZ 电击转化毕赤酵母 GS115 | 第63-64页 |
| ·重组酵母甲醇利用表型的筛选 | 第64-65页 |
| ·重组酵母高拷贝转化子的筛选 | 第65-66页 |
| ·重组酵母基因组的提取及整合情况的PCR 鉴定 | 第66-67页 |
| ·重组谷氨酰胺转胺酶的诱导表达及活性检测 | 第67页 |
| ·重组谷氨酰胺转胺酶对酪蛋白的交联作用 | 第67-68页 |
| ·讨论 | 第68-69页 |
| ·本章小结 | 第69-70页 |
| 第6章 玉米谷氨酰胺转氨酶的初步分离酶学性质研究 | 第70-74页 |
| ·天然玉米TGase 硫酸铵分级沉淀 | 第70-71页 |
| ·玉米TGase 的初步酶学性质测定 | 第71-72页 |
| ·不同的TGase 的用量对酪蛋白的交联 | 第71页 |
| ·不同的反应温度下对酪蛋白的交联 | 第71-72页 |
| ·不同pH 下玉米TGase 对酪蛋白的催化反应 | 第72页 |
| ·讨论 | 第72-73页 |
| ·本章小节 | 第73-74页 |
| 结论 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
