| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-36页 |
| 1 植物脂肪酸的生物合成途径 | 第13-17页 |
| ·脂肪酸的种类 | 第13-14页 |
| ·植物脂肪酸生物合成途径 | 第14-17页 |
| 2 芥酸的生物合成与遗传 | 第17-21页 |
| ·芥酸的作用 | 第17-18页 |
| ·芥酸含量的遗传 | 第18-19页 |
| ·芥酸的生物合成 | 第19-21页 |
| 3 芥酸的生物合成与基因调控 | 第21-27页 |
| ·脂肪酸延长基因(FAE1) | 第21-24页 |
| ·芥酸生物合成的基因工程 | 第24-27页 |
| ·低芥酸油菜的基因工程 | 第24-25页 |
| ·高芥酸油菜的基因工程 | 第25-27页 |
| 4 RNAI研究背景及其应用 | 第27-34页 |
| ·RNAi的发现 | 第27-28页 |
| ·RNAi的产生机制 | 第28-30页 |
| ·RNAi在植物中的应用 | 第30-34页 |
| ·RNAi在植物功能基因组研究中的应用 | 第30-31页 |
| ·RNAi在植物品质改良中的应用 | 第31-32页 |
| ·降低作物中有害物质的含量 | 第32-33页 |
| ·RNAi在提高植物抗病性的应用 | 第33-34页 |
| 5 研究的目的意义、原理、主要内容和技术路线 | 第34-36页 |
| ·研究的目的、意义 | 第34页 |
| ·技术原理 | 第34-35页 |
| ·技术路线 | 第35-36页 |
| 第二章 甘蓝型油菜FAE1 RNAI表达载体的构建 | 第36-61页 |
| 1 材料与方法 | 第36-38页 |
| ·主要仪器设备与生产厂家 | 第36-37页 |
| ·质粒与菌株 | 第37页 |
| ·分子生物学试剂及Kit | 第37页 |
| ·生化试剂 | 第37页 |
| ·主要试剂配制 | 第37-38页 |
| ·PCR引物 | 第38页 |
| 2 实验方法 | 第38-54页 |
| ·油菜总DNA提取 | 第38-39页 |
| ·pUC19.RBi、pCAMBIA1301、pUC19.RBi1质粒DNA的提取 | 第39-40页 |
| ·组成fae1 RNA干扰体5个片段的序列来源、结构设计 | 第40-41页 |
| ·启动子 | 第40页 |
| ·干扰体茎体(Stem)部分 | 第40页 |
| ·环体(Loop) | 第40-41页 |
| ·终止子caMV3'UTR(polyA signal) | 第41页 |
| ·组成fae1 RNA干扰体5个片段的克隆 | 第41-42页 |
| ·Napin pro、fae1-1、fae1-2三个片段的PCR扩增 | 第41页 |
| ·rbcs-3C intron片段扩增 | 第41-42页 |
| ·caMV 3' UTR片段扩增 | 第42页 |
| ·PCR产物检测 | 第42-43页 |
| ·PCR产物的胶回收纯化 | 第43-44页 |
| ·PCR产物胶回收片段与T-载体的连接 | 第44页 |
| ·连接产物的细菌转化 | 第44页 |
| ·筛选后PCR鉴定 | 第44-45页 |
| ·重组质粒测序 | 第45页 |
| ·fae1 RNAi克隆载体构建 | 第45-52页 |
| ·中间载体pUC19.BNp、pUC19.3C的构建 | 第45-46页 |
| ·pUC19.BNp质粒的建立 | 第46页 |
| ·pUC19.3C质粒的建立 | 第46-47页 |
| ·油菜fae1 RNAi体各片段的组装 | 第47-52页 |
| ·fae1 RNAi植物表达载体的构建 | 第52-53页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第53页 |
| ·pCAMBIA3301-fae1i向农杆菌的导入 | 第53页 |
| ·以pCAMBIA3301-fae1i质粒转化农杆菌的PCR验证 | 第53-54页 |
| 3 结果与分析 | 第54-58页 |
| ·fae1 RNAi载体5个组成片段的克隆及序列测定结果 | 第54-55页 |
| ·fae1 RNAi干扰载体的测序验证 | 第55-56页 |
| ·fae1 RNAi载体的构建结果 | 第56页 |
| ·fae1-1.3C.fae1-2重组体的鉴定 | 第56页 |
| ·Pro.BNp.CaMV 3' UTR重组体的鉴定 | 第56页 |
| ·油菜fae1 RNAi载体的鉴定 | 第56-57页 |
| ·油菜fae1 RNAi植物表达载体的鉴定 | 第57页 |
| ·以pCAMBIA3301-fae1i质粒转化农杆菌的PCR验证结果 | 第57-58页 |
| 4 讨论 | 第58-61页 |
| ·转录形成mRNA发卡结构,形成dsRNA诱导产生RNAi | 第58-59页 |
| ·关于对fae1-1、fae1-2两个干扰片段的克隆途径 | 第59页 |
| ·关于fae1 RNA干扰体启动子的选择 | 第59-60页 |
| ·构建hpRNA高效表达载体是RNAi技术应用的关键 | 第60-61页 |
| 第三章 根癌农杆菌介导FAE1 RNAI转化甘蓝型油菜 | 第61-72页 |
| 1. 材料和方法 | 第61-66页 |
| ·材料 | 第61-63页 |
| ·主要仪器设备 | 第61页 |
| ·供试材料 | 第61页 |
| ·菌株及质粒 | 第61页 |
| ·培养基 | 第61-62页 |
| ·试剂 | 第62页 |
| ·酶 | 第62页 |
| ·PCR引物 | 第62-63页 |
| ·方法 | 第63-66页 |
| ·初始材料的获得 | 第63页 |
| ·培养条件 | 第63页 |
| ·苗龄对油菜子叶柄分化的影响实验 | 第63页 |
| ·PPT选择剂浓度的确定 | 第63页 |
| ·油菜的遗传转化 | 第63-64页 |
| ·抗性植株的检测 | 第64-66页 |
| 2. 结果 | 第66-70页 |
| ·PPT选择剂浓度的确定 | 第66-67页 |
| ·延迟筛选时间对子叶柄遗传转化的影响 | 第67-68页 |
| ·不同基因型对转化频率的影响 | 第68页 |
| ·fae1 RNAi转基因油菜GUS组织化学染色检测 | 第68-70页 |
| 3. 讨论 | 第70-72页 |
| ·关于影响农杆菌介导油菜子叶柄遗传转化的因素探讨 | 第70页 |
| ·试管苗移栽成活是植物组织培养的一个重要环节 | 第70-72页 |
| 第四章 RNAI对FAE1的基因沉默效果及芥酸合成的影响分析 | 第72-97页 |
| 1 实验材料 | 第72-74页 |
| ·植物材料 | 第72页 |
| ·主要仪器设备与生产厂家 | 第72页 |
| ·菌株和载体 | 第72页 |
| ·实验试剂配制 | 第72-74页 |
| ·DNA和质粒提取及电泳检测的相关试剂 | 第72-74页 |
| ·Southern blot相关试剂 | 第74页 |
| ·RNA的提取半定量RT-PCR相关试剂 | 第74页 |
| 2 实验方法 | 第74-84页 |
| ·基因组DNA质量及浓度检测 | 第74-76页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳鉴定油菜叶片基因组DNA | 第75页 |
| ·油菜叶片总DNA定量分析 | 第75-76页 |
| ·PCR检测转基因油菜 | 第76页 |
| ·引物设计 | 第76页 |
| ·PCR体系的建立 | 第76页 |
| ·Southern blot | 第76-79页 |
| ·酶切和凝胶电泳 | 第76-77页 |
| ·标记探针的制备 | 第77-78页 |
| ·转膜 | 第78页 |
| ·杂交 | 第78页 |
| ·洗膜、信号检测 | 第78-79页 |
| ·基因表达半定量RT-PCR分析 | 第79-83页 |
| ·油菜幼嫩种子RNA的提取 | 第79-80页 |
| ·普通琼脂糖凝胶电泳鉴定油菜幼嫩种子总RNA的质量 | 第80页 |
| ·RNA样品中残留的DNA的消化 | 第80页 |
| ·普通琼脂糖凝胶电泳鉴定DNaseI消化后油菜幼嫩种子总RNA | 第80页 |
| ·紫外分光光度计测定DNase I消化后总RNA的质量与浓度 | 第80-81页 |
| ·基因表达分析 | 第81-83页 |
| ·转基因植株的遗传 | 第83页 |
| ·脂肪酸组成的检测 | 第83-84页 |
| 3 结果与分析 | 第84-94页 |
| ·抗性植株PCR扩增电泳检测 | 第84-85页 |
| ·Southern Blot结果分析 | 第85-87页 |
| ·DNA限制性内切酶酶切效果检验 | 第85-86页 |
| ·探针的制备 | 第86页 |
| ·Southern Blot分析 | 第86-87页 |
| ·FAE1基因的表达分析 | 第87-92页 |
| ·RNA的提取 | 第87-89页 |
| ·PCR模板量的确定和指数增长期的确定 | 第89-91页 |
| ·fae1基因在幼嫩种子中的表达分析 | 第91-92页 |
| ·脂肪酸组成分析 | 第92-94页 |
| 4 讨论 | 第94-97页 |
| ·报告基因的选择 | 第94-95页 |
| ·关于GUS检测与PCR扩增检测结果存在出入的因素探讨 | 第95-96页 |
| ·关于RNAi对fae1基因沉默效果及对芥酸形成的影响分析 | 第96-97页 |
| 结论 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-116页 |
| 致谢 | 第116-117页 |
| 附录1 博士研究生期间发表的论文 | 第117-118页 |
| 附录2 DNA MARKER和载体图谱 | 第118-120页 |
| 附录3 植物表达载体PCAMBIA3301-FAE1I质粒图谱 | 第120-121页 |
| 附录4 FAE1 RNA干扰体构建流程图 | 第121-122页 |
| 附录5 NAPIN基因启动子测序彩图 | 第122-123页 |
| 附录6 油菜转化体系流程及成苗图片 | 第123页 |
