| 摘要 | 第9-11页 |
| abstract | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-25页 |
| 1.1 黔北麻羊概况 | 第13-14页 |
| 1.2 Toll样受体的发现及分布 | 第14页 |
| 1.3 TLRs的结构及功能 | 第14-17页 |
| 1.4 TLRs信号转导通路 | 第17-18页 |
| 1.5 TLR4基因研究概括 | 第18-21页 |
| 1.5.1 TLR4结构功能及调节机制 | 第18-19页 |
| 1.5.2 TLR4在天然免疫中的生物学作用 | 第19-20页 |
| 1.5.3 TLR4在羊抗病方面的研究进展 | 第20-21页 |
| 1.6 TLR4与LPS的相互作用 | 第21-22页 |
| 1.7 LPS与炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α | 第22-23页 |
| 1.8 本研究的目的与意义 | 第23-25页 |
| 第二章 黔北麻羊TLR4基因多态性检测及生物信息学分析 | 第25-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-26页 |
| 2.1.1 实验样本 | 第25页 |
| 2.1.2 主要仪器设备 | 第25-26页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-29页 |
| 2.2.1 黔北麻羊基因组DNA提取 | 第26-27页 |
| 2.2.2 DNA质量检测 | 第27页 |
| 2.2.3 构建黔北麻羊DNA池 | 第27-28页 |
| 2.2.4 引物设计及合成 | 第28页 |
| 2.2.5 引物的溶解与稀释 | 第28页 |
| 2.2.6 PCR反应体系及试验步骤 | 第28-29页 |
| 2.3 黔北麻羊TLR4基因外显子多态性检测 | 第29-30页 |
| 2.3.1 黔北麻羊品种DNA池SNPs筛选 | 第29-30页 |
| 2.3.2 黔北麻羊TLR4基因SNPs分析 | 第30页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第30-35页 |
| 2.4.1 黔北麻羊基因组DNA检测结果 | 第30页 |
| 2.4.2 黔北麻羊TLR4基因外显子扩增结果 | 第30-31页 |
| 2.4.3 黔北麻羊DNA池筛选TLR4基因多态性 | 第31-32页 |
| 2.4.4 黔北麻羊TLR4基因生物信息学分析 | 第32-33页 |
| 2.4.4.1 黔北麻羊TLR4基因mRNA二级结构预测 | 第32页 |
| 2.4.4.2 黔北麻羊TLR4基因三级结构分析 | 第32-33页 |
| 2.4.4.3 TLR4蛋白跨膜螺旋分析 | 第33页 |
| 2.4.5 讨论 | 第33-35页 |
| 第三章 黔北麻羊TLR4基因在小鼠巨噬细胞中的表达及其对TLR2基因表达的影响 | 第35-57页 |
| 3.1 材料与方法 | 第35-36页 |
| 3.1.1 实验样品 | 第35页 |
| 3.1.2 实验试剂 | 第35页 |
| 3.1.3 主要仪器设备 | 第35页 |
| 3.1.4 常用试剂的配置 | 第35-36页 |
| 3.2 实验方法 | 第36-37页 |
| 3.2.1 组织RNA的提取 | 第36页 |
| 3.2.2 总RNA质量检测 | 第36页 |
| 3.2.3 cDNA第一条链的合成 | 第36-37页 |
| 3.3 黔北麻羊TLR4基因CDS区的克隆 | 第37-38页 |
| 3.3.1 TLR4基因CDS区引物设计 | 第37页 |
| 3.3.2 TLR4基因CDS区扩增 | 第37-38页 |
| 3.3.3 TLR4基因CDS区扩增产物的胶回收纯化 | 第38页 |
| 3.4 重组表达载体pEGFP-NI-TLR4的构建及鉴定 | 第38-41页 |
| 3.4.1 TLR4基因CDS区与pEGFP-N1载体的连接 | 第38页 |
| 3.4.2 大肠杆菌TOP10感受态细胞的制备 | 第38-39页 |
| 3.4.3 重组质粒pEGFP-N1-TLR4的构建 | 第39页 |
| 3.4.4 重组质粒的提取 | 第39-41页 |
| 3.4.5 重组质粒pEGFP-N1-TLR4的鉴定 | 第41页 |
| 3.5 生物信息学分析方法 | 第41页 |
| 3.6 小鼠巨噬细胞Ana-1的培养 | 第41-42页 |
| 3.7 TLR4基因在小鼠巨噬细胞中的表达及其对TLR2基因表达的影响 | 第42-44页 |
| 3.7.1 质粒转染方法 | 第42-43页 |
| 3.7.2 细胞RNA的提取 | 第43页 |
| 3.7.3 荧光引物设计 | 第43-44页 |
| 3.8 qRT-PCR检测TLR4和TLR2基因相对表达量 | 第44页 |
| 3.9 数据分析 | 第44-45页 |
| 3.10 结果与分析 | 第45页 |
| 3.10.1 组织RNA的纯度检测 | 第45页 |
| 3.10.2 TLR4基因CDS克隆 | 第45页 |
| 3.11 目的基因CDS区胶回收产物检测 | 第45-46页 |
| 3.12 重组表达载体pEGFP-NI-TLR4的鉴定 | 第46-47页 |
| 3.12.1 pEGFP-NI-TLR4的菌液PCR及测序鉴定 | 第46-47页 |
| 3.12.2 pEGFP-NI-TLR4的双酶切鉴定 | 第47页 |
| 3.13 黔北麻羊TLR4基因CDS区生物信息学分析 | 第47-51页 |
| 3.13.1 TLR4基因CDS区生物信息学分析 | 第47-48页 |
| 3.13.2 TLR4蛋白理化性质分析 | 第48-49页 |
| 3.13.3 TLR4蛋白二级结构分析 | 第49-50页 |
| 3.13.4 黔北麻羊TLR4基因抗原表位预测 | 第50页 |
| 3.13.5 TLR4蛋白的功能结构域预测 | 第50-51页 |
| 3.14 pEGFP-NI-TLR4重组质粒在小鼠巨噬细胞中的表达 | 第51-53页 |
| 3.14.1 小鼠巨噬细胞的培养 | 第51页 |
| 3.14.2 pEGFP-NI-TLR4在小鼠巨噬细胞的瞬时转染 | 第51-53页 |
| 3.15 TLR4基因上调对小鼠巨噬细胞TLR2基因的影响 | 第53-54页 |
| 3.15.1 qRT-PCR产物特异性分析 | 第53页 |
| 3.15.2 TLR4基因和TLR2基因的qRT-PCR结果分析 | 第53-54页 |
| 3.16 讨论 | 第54-57页 |
| 第四章 LPS刺激转染细胞后IL-1、IL-6和TNF-α的变化 | 第57-68页 |
| 4.1 材料与方法 | 第57页 |
| 4.1.1 细胞 | 第57页 |
| 4.1.2 实验试剂 | 第57页 |
| 4.1.3 仪器设备 | 第57页 |
| 4.2 实验方法 | 第57-58页 |
| 4.2.1 小鼠巨噬细胞的培养 | 第57页 |
| 4.2.2 细胞转染 | 第57-58页 |
| 4.2.3 LPS刺激方法 | 第58页 |
| 4.2.4 细胞上清的收集 | 第58页 |
| 4.3 Elisa检测 | 第58-59页 |
| 4.3.1 IL-1、IL-6及TNF-α标准曲线建立 | 第58-59页 |
| 4.3.2 细胞炎症因子的测定 | 第59页 |
| 4.4 标准曲线的建立 | 第59页 |
| 4.5 不同LPS浓度与胞内炎症因子表达的关联性分析 | 第59页 |
| 4.6 结果与分析 | 第59-62页 |
| 4.6.1 IL-1、IL-6及TNF-α标准曲线 | 第59-60页 |
| 4.6.2 小鼠巨噬细胞中免疫因子检测结果 | 第60-62页 |
| 4.7 LPS诱导转染细胞后细胞因子的动态及变化趋势 | 第62-65页 |
| 4.7.1 LPS诱导后IL-1分泌动态变化及变化趋势 | 第62-63页 |
| 4.7.2 LPS诱导后IL-6分泌动态变化及变化趋势 | 第63-64页 |
| 4.7.3 LPS诱导后TNF-α分泌动态变化及变化趋势 | 第64-65页 |
| 4.8 LPS刺激后细胞因子含量比较 | 第65页 |
| 4.9 讨论 | 第65-68页 |
| 第五章 结论与展望 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 附录Ⅰ | 第79-80页 |
| 附录Ⅱ | 第80-81页 |
