| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第1章 绪论 | 第11-21页 |
| 1.1 棉花黄萎病研究进展 | 第11-13页 |
| 1.1.1 棉花 | 第11页 |
| 1.1.2 棉花黄萎病 | 第11-12页 |
| 1.1.3 黄萎病菌致病机理研究 | 第12-13页 |
| 1.1.4 棉花抗黄萎病机制研究 | 第13页 |
| 1.2 植物miR319及其靶基因MYB33功能的研究进展 | 第13-20页 |
| 1.2.1 植物miRNA简介 | 第13-14页 |
| 1.2.2 棉花miRNA研究 | 第14-17页 |
| 1.2.3 miR319功能研究 | 第17-18页 |
| 1.2.4 MYB转录因子功能研究 | 第18-20页 |
| 1.3 本研究的目的和意义 | 第20-21页 |
| 第2章 棉花miRNA表达量检测方法Stem-loopRT-PCR的建立 | 第21-29页 |
| 2.1 材料与方法 | 第21-24页 |
| 2.1.1 生物材料 | 第21页 |
| 2.1.2 引物序列设计 | 第21-22页 |
| 2.1.3 TRIzol法提取棉花总RNA | 第22-23页 |
| 2.1.4 反转录RT-PCR | 第23页 |
| 2.1.5 半定量RT-PCR | 第23-24页 |
| 2.1.6 实时荧光定量PCR | 第24页 |
| 2.1.7 扩增效率的计算 | 第24页 |
| 2.2 结果与分析 | 第24-28页 |
| 2.2.1 棉花总RNA提取 | 第24-25页 |
| 2.2.2 引物扩增效率检验 | 第25-26页 |
| 2.2.3 Stem-loopRT-PCR方法的灵敏度检测 | 第26-27页 |
| 2.2.4 Stem-loopRT-PCR分析棉花miRNA表达谱 | 第27-28页 |
| 2.3 小结 | 第28-29页 |
| 第3章 ghr-miR319及其靶基因的鉴定 | 第29-39页 |
| 3.1 材料与方法 | 第29-34页 |
| 3.1.1 生物材料 | 第29页 |
| 3.1.2 数据库与生物信息分析软件 | 第29页 |
| 3.1.3 陆地棉miR319及其靶基因的生物信息学分析 | 第29-30页 |
| 3.1.4 CTAB法提取棉花DNA | 第30页 |
| 3.1.5 构建MIR319载体 | 第30-31页 |
| 3.1.6 构建GhMYB33-GUS载体 | 第31-32页 |
| 3.1.7 构建GhMYB33突变基因mGhMYB33-GUS载体 | 第32-33页 |
| 3.1.8 农杆菌介导转化烟草叶片 | 第33页 |
| 3.1.9 GUS组织染色 | 第33页 |
| 3.1.10 TRIzol法提取棉花总RNA | 第33页 |
| 3.1.11 反转录RT-PCR | 第33-34页 |
| 3.1.12 实时荧光定量PCR | 第34页 |
| 3.2 结果与分析 | 第34-38页 |
| 3.2.1 陆地棉miR319的鉴定 | 第34页 |
| 3.2.2 GhMYB33的鉴定 | 第34-35页 |
| 3.2.3 ghr-miR319与其靶基因GhMYB33的识别 | 第35-36页 |
| 3.2.4 ghr-miR319与其靶基因GhMYB33的相关关系 | 第36页 |
| 3.2.5 在本氏烟叶中瞬时表达ghr-miR319调控其靶基因GhMYB33 | 第36-38页 |
| 3.3 小结 | 第38-39页 |
| 第4章 ghr-miR319及其靶基因的功能研究 | 第39-47页 |
| 4.1 材料与方法 | 第39-43页 |
| 4.1.1 生物材料 | 第39页 |
| 4.1.2 构建过表达ghr-miR319载体 | 第39-40页 |
| 4.1.3 构建沉默ghr-miR319载体 | 第40-41页 |
| 4.1.4 构建沉默GhMYB33载体 | 第41页 |
| 4.1.5 病毒介导的基因沉默 | 第41-42页 |
| 4.1.6 大丽轮枝菌V991的活化、培养及侵染 | 第42页 |
| 4.1.7 棉花病情指数统计 | 第42页 |
| 4.1.8 反转录RT-PCR | 第42页 |
| 4.1.9 实时荧光定量PCR | 第42-43页 |
| 4.1.10 半定量RT-PCR | 第43页 |
| 4.2 结果与分析 | 第43-46页 |
| 4.2.1 过表达ghr-miR319提高了陆地棉对大丽轮枝菌的抗性 | 第43-44页 |
| 4.2.2 抑制ghr-miR319的表达降低了陆地棉对大丽轮枝菌的抵御能力.. | 第44-45页 |
| 4.2.3 沉默GhMYB33的表达提高了陆地棉对大丽轮枝菌的抗性 | 第45-46页 |
| 4.3 小结 | 第46-47页 |
| 第5章 ghr-miR319参与陆地棉抗黄萎病的分子机制分析 | 第47-56页 |
| 5.1 材料与方法 | 第47-51页 |
| 5.1.1 生物材料 | 第47页 |
| 5.1.2 构建沉默GhSPL9载体 | 第47-48页 |
| 5.1.3 构建GhMYB33::GFP表达载体 | 第48页 |
| 5.1.4 构建GhSPL9pro::LUC载体 | 第48-49页 |
| 5.1.5 荧光素酶检测 | 第49-50页 |
| 5.1.6 反转录RT-PCR | 第50页 |
| 5.1.7 半定量RT-PCR | 第50页 |
| 5.1.8 实时荧光定量PCR | 第50页 |
| 5.1.9 提取陆地棉花青素 | 第50页 |
| 5.1.10 VIGS介导的基因沉默 | 第50页 |
| 5.1.11 大丽轮枝菌V991的活化、培养及侵染 | 第50-51页 |
| 5.2 结果与分析 | 第51-55页 |
| 5.2.1 GhMYB33转录激活下游基因GhSPL9的表达 | 第51-52页 |
| 5.2.2 沉默GhSPL9的表达提高了陆地棉对大丽轮枝菌的抗性 | 第52-53页 |
| 5.2.3 过表达ghr-miR319和沉默GhMYB33促进陆地棉花青素积累 | 第53-54页 |
| 5.2.4 沉默ghr-miR319表达导致陆地棉中花青素积累量减少 | 第54-55页 |
| 5.2.5 ghr-miR319参与陆地棉抗病响应模型 | 第55页 |
| 5.3 小结 | 第55-56页 |
| 第6章 结束语 | 第56-59页 |
| 6.1 优化了一套鉴定棉花miRNA表达丰度系统方法 | 第56页 |
| 6.2 揭示了miR319-MYB33-SPL9-DFR途径抗病响应机制 | 第56页 |
| 6.3 讨论 | 第56-59页 |
| 6.3.1 miR319参与陆地棉抗病响应 | 第57页 |
| 6.3.2 GhMYB33参与陆地棉花青素合成途径 | 第57-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-68页 |
| 作者在学期间取得的学术成果 | 第68-69页 |
| 附录1 MIR319和GhMYB33核苷酸序列 | 第69页 |
