| 学位论文数据集 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 第一章 绪论 | 第23-39页 |
| 1.1 硫酸软骨素 | 第23-24页 |
| 1.1.1 硫酸软骨素分类 | 第23-24页 |
| 1.1.2 硫酸软骨素作用 | 第24页 |
| 1.2 硫酸软骨素裂解酶 | 第24-27页 |
| 1.2.1 硫酸软骨素裂解酶分类 | 第24-25页 |
| 1.2.2 硫酸软骨素裂解酶用途 | 第25页 |
| 1.2.3 硫酸软骨素裂解酶研究进展 | 第25-27页 |
| 1.3 三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) | 第27-28页 |
| 1.4 代谢工程研究进展 | 第28页 |
| 1.5 莽草酸途径 | 第28-33页 |
| 1.5.1 莽草酸途径中的酶 | 第28-29页 |
| 1.5.2 芳香族氨基酸的生物合成 | 第29-30页 |
| 1.5.3 苯丙基类化合物的生物合成 | 第30-33页 |
| 1.6 芳香族化合物 | 第33-35页 |
| 1.6.1 木质素单体醇 | 第33页 |
| 1.6.2 香草醇 | 第33-34页 |
| 1.6.3 没食子酸 | 第34-35页 |
| 1.7 本论文的立项依据和研究内容 | 第35-39页 |
| 1.7.1 本论文的立项依据 | 第35页 |
| 1.7.2 本论文的研究内容 | 第35-39页 |
| 第二章 基因工程基本实验操作 | 第39-45页 |
| 2.1 PCR过程 | 第39页 |
| 2.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第39-40页 |
| 2.3 胶回收过程 | 第40页 |
| 2.4 质粒提取过程 | 第40-41页 |
| 2.5 酶切 | 第41页 |
| 2.6 连接 | 第41-42页 |
| 2.7 化学转化 | 第42-43页 |
| 2.7.1 感受态细胞的制备 | 第42页 |
| 2.7.2 化学转化过程 | 第42-43页 |
| 2.8 电转化 | 第43页 |
| 2.9 培养基与抗生素配方 | 第43-44页 |
| 2.10 蛋白电泳 | 第44-45页 |
| 第三章 融合蛋白MBP-ChSase ABCⅠ的表达研究 | 第45-55页 |
| 3.1 引言 | 第45页 |
| 3.2 实验材料 | 第45页 |
| 3.2.1 实验试剂 | 第45页 |
| 3.2.2 实验菌株和质粒 | 第45页 |
| 3.3 实验方法 | 第45-47页 |
| 3.3.1 ChSase ABCⅠ基因的扩增 | 第45-46页 |
| 3.3.2 重组质粒pMAL-c2x-ChSase ABCⅠ的构建 | 第46页 |
| 3.3.3 融合蛋白MBP-ChSase ABCⅠ的表达 | 第46页 |
| 3.3.4 融合蛋白MBP-ChSase ABCⅠ的纯化 | 第46-47页 |
| 3.3.5 ChSase ABCⅠ的酶活检测 | 第47页 |
| 3.3.6 温度和pH优化 | 第47页 |
| 3.3.7 酶动力学常数的测定 | 第47页 |
| 3.3.8 热稳定性检测 | 第47页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第47-53页 |
| 3.4.1 ChSase ABCⅠ基因的扩增 | 第48页 |
| 3.4.2 重组质粒pMAL-c2x-ChSase ABCⅠ的构建 | 第48页 |
| 3.4.3 融合蛋白MBP-ChSase ABCⅠ的表达宿主优化 | 第48-49页 |
| 3.4.4 融合蛋白MBP-ChSase ABCⅠ的纯化 | 第49-50页 |
| 3.4.5 温度和pH优化 | 第50-52页 |
| 3.4.6 融合蛋白MBP-ChSase ABCⅠ的动力学常数测定 | 第52页 |
| 3.4.7 融合蛋白MBP-ChSase ABCⅠ的热稳定性测定 | 第52-53页 |
| 3.5 本章小结 | 第53-55页 |
| 第四章 His标签对ChSase ABCⅠ的性质影响研究 | 第55-65页 |
| 4.1 引言 | 第55页 |
| 4.2 实验材料 | 第55页 |
| 4.2.1 实验试剂 | 第55页 |
| 4.2.2 实验菌株和质粒 | 第55页 |
| 4.3 实验方法 | 第55-58页 |
| 4.3.1 重组质粒的构建pET15D-ChSase ABCⅠ | 第55-56页 |
| 4.3.2 融合蛋白His-ChSase ABCⅠ的表达 | 第56页 |
| 4.3.3 融合蛋白His-ChSase ABCⅠ和ChSase ABCⅠ的纯化 | 第56-57页 |
| 4.3.4 ChSase ABCⅠ的酶活检测 | 第57页 |
| 4.3.5 His-ChSase ABCⅠ和ChSase ABCⅠ的聚合状态检测 | 第57页 |
| 4.3.6 温度和pH优化 | 第57页 |
| 4.3.7 酶动力学常数的测定 | 第57页 |
| 4.3.8 热稳定性检测 | 第57页 |
| 4.3.9 His-ChSase ABCⅠ和ChSase ABCⅠ的二级结构检测 | 第57-58页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第58-64页 |
| 4.4.1 重组质粒pET15D-ChSase ABCⅠ的构建 | 第58页 |
| 4.4.2 融合蛋白His-ChSase ABCⅠ的纯化 | 第58-59页 |
| 4.4.3 融合蛋白His-ChSase ABCⅠ和ChSase ABCⅠ的比酶活 | 第59-60页 |
| 4.4.4 His-ChSase ABCⅠ和ChSase ABCⅠ的聚合状态检测 | 第60-61页 |
| 4.4.5 最适温度和pH的检测 | 第61-62页 |
| 4.4.6 酶动力学常数的测定 | 第62页 |
| 4.4.7 热稳定性的研究 | 第62-63页 |
| 4.4.8 His-ChSase ABCⅠ和ChSase ABCⅠ的二级结构检测 | 第63-64页 |
| 4.5 本章小结 | 第64-65页 |
| 第五章 定点突变提高ChSase ABCⅠ的酶活 | 第65-77页 |
| 5.1 引言 | 第65页 |
| 5.2 实验材料 | 第65页 |
| 5.2.1 实验试剂 | 第65页 |
| 5.2.2 实验菌株和质粒 | 第65页 |
| 5.3 实验方法 | 第65-68页 |
| 5.3.1 pMAL-c2x-ChSase ABCⅠ的定点突变 | 第65-67页 |
| 5.3.2 融合蛋白MBP-ChSase ABCⅠ的表达与纯化 | 第67页 |
| 5.3.3 ChSase ABCⅠ的酶活检测 | 第67页 |
| 5.3.4 酶动力学常数的测定 | 第67-68页 |
| 5.3.5 热稳定性检测 | 第68页 |
| 5.3.6 分子模拟 | 第68页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第68-75页 |
| 5.4.1 突变氨基酸的选定 | 第68-70页 |
| 5.4.2 突变体比酶活测定 | 第70-73页 |
| 5.4.3 突变体动力学常数的测定 | 第73页 |
| 5.4.4 突变体热稳定性的测定 | 第73-74页 |
| 5.4.5 突变体表面结构分析 | 第74-75页 |
| 5.5 本章小结 | 第75-77页 |
| 第六章 GAPDH提高ChSase ABCⅠ的表达水平 | 第77-93页 |
| 6.1 引言 | 第77页 |
| 6.2 实验材料 | 第77-78页 |
| 6.2.1 实验试剂 | 第77-78页 |
| 6.2.2 实验菌株和质粒 | 第78页 |
| 6.3 实验方法 | 第78-82页 |
| 6.3.1 重组质粒的构建 | 第78-80页 |
| 6.3.2 重组蛋白的表达与纯化 | 第80页 |
| 6.3.3 Western blot和Q-TOF分析蛋白 | 第80-81页 |
| 6.3.4 ChSase ABCⅠ的酶活检测 | 第81页 |
| 6.3.5 mRNA水平检测 | 第81页 |
| 6.3.6 发酵条件优化 | 第81页 |
| 6.3.7 温度和pH优化 | 第81页 |
| 6.3.8 酶动力学常数的测定 | 第81-82页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第82-90页 |
| 6.4.1 重组质粒的构建 | 第82页 |
| 6.4.2 Western blot和Q-TOF分析蛋白 | 第82-83页 |
| 6.4.3 ChSase ABCⅠ和GAPDH-ChSase ABCⅠ的酶活检测 | 第83-84页 |
| 6.4.4 mRNA水平检测 | 第84-85页 |
| 6.4.5 GAPDH和MBP的对比 | 第85-86页 |
| 6.4.6 发酵条件优化 | 第86-88页 |
| 6.4.7 GAPDH-ChSase ABCⅠ的比酶活 | 第88页 |
| 6.4.8 GAPDH对ChSase ABCⅠ的最适温度和pH的影响 | 第88-89页 |
| 6.4.9 GAPDH-ChSase ABCⅠ的动力学常数检测 | 第89-90页 |
| 6.4.10 GAPDH对其他多糖裂解酶的效果 | 第90页 |
| 6.5 本章小结 | 第90-93页 |
| 第七章 利用共培养方法合成木质素单体醇 | 第93-109页 |
| 7.1 引言 | 第93页 |
| 7.2 实验材料 | 第93-95页 |
| 7.2.1 实验试剂 | 第93页 |
| 7.2.2 实验菌株和质粒 | 第93-95页 |
| 7.3 实验方法 | 第95-98页 |
| 7.3.1 重组质粒的构建 | 第95-97页 |
| 7.3.2 喂养实验 | 第97页 |
| 7.3.3 HpaBC的体外和体内酶活测定 | 第97页 |
| 7.3.4 从头合成实验 | 第97-98页 |
| 7.3.5 HPLC检测 | 第98页 |
| 7.4 结果与讨论 | 第98-108页 |
| 7.4.1 高效率酶的选取 | 第98-99页 |
| 7.4.2 喂养实验 | 第99-101页 |
| 7.4.3 从头合成香豆酸和香豆醇 | 第101-102页 |
| 7.4.4 共培养生产咖啡醇 | 第102-105页 |
| 7.4.5 共培养生产松柏醇 | 第105-107页 |
| 7.4.6 咖啡醇的放大实验 | 第107-108页 |
| 7.5 本章小结 | 第108-109页 |
| 第八章 基于COMT的底物多样性实现香草醇生物合成 | 第109-123页 |
| 8.1 引言 | 第109页 |
| 8.2 实验材料 | 第109-111页 |
| 8.2.1 实验试剂 | 第109页 |
| 8.2.2 实验菌株和质粒 | 第109-111页 |
| 8.3 实验方法 | 第111-114页 |
| 8.3.1 重组质粒的构建 | 第111-112页 |
| 8.3.2 COMT体外酶活检测 | 第112-113页 |
| 8.3.3 喂养实验 | 第113页 |
| 8.3.4 从头合成实验 | 第113页 |
| 8.3.5 HPLC检测 | 第113-114页 |
| 8.4 结果与讨论 | 第114-121页 |
| 8.4.1 途径设计 | 第114-116页 |
| 8.4.2 COMT体外酶活检测 | 第116-117页 |
| 8.4.3 喂养实验 | 第117-119页 |
| 8.4.4 香草醇的从头合成 | 第119-120页 |
| 8.4.5 模块化优化 | 第120-121页 |
| 8.5 本章小结 | 第121-123页 |
| 第九章 蛋白质工程改造PobA来实现没食子酸生物合成 | 第123-137页 |
| 9.1 引言 | 第123页 |
| 9.2 实验材料 | 第123-125页 |
| 9.2.1 实验试剂 | 第123页 |
| 9.2.2 实验菌株和质粒 | 第123-125页 |
| 9.3 实验方法 | 第125-128页 |
| 9.3.1 重组质粒的构建 | 第125-126页 |
| 9.3.2 突变体的理性设计 | 第126页 |
| 9.3.3 PobA及突变的体外酶活检测 | 第126-127页 |
| 9.3.4 喂养实验 | 第127页 |
| 9.3.5 从头合成实验 | 第127页 |
| 9.3.6 HPLC检测 | 第127-128页 |
| 9.4 结果与讨论 | 第128-136页 |
| 9.4.1 突变氨基酸的选定 | 第128-130页 |
| 9.4.2 野生型和突变体体外酶活的测定 | 第130-131页 |
| 9.4.3 喂养实验 | 第131-134页 |
| 9.4.4 没食子酸的从头合成 | 第134-135页 |
| 9.4.5 过表达APTA和UbiC提高没食子酸产量 | 第135-136页 |
| 9.5 本章小结 | 第136-137页 |
| 第十章 结论与展望 | 第137-139页 |
| 10.1 结论 | 第137-138页 |
| 10.2 创新点 | 第138页 |
| 10.3 展望 | 第138-139页 |
| 附录 | 第139-141页 |
| 附录1 | 第139-140页 |
| 附录2 | 第140-141页 |
| 参考文献 | 第141-153页 |
| 致谢 | 第153-155页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第155-157页 |
| 发表及已接收的论文 | 第155-157页 |
| 作者简介 | 第157页 |
| 导师简介 | 第157-158页 |
| 附件 | 第158-159页 |
