| 摘要 | 第8-9页 |
| 1 文献综述 | 第9-17页 |
| 1.1 紫花苜蓿的营养价值 | 第9-10页 |
| 1.2 苜蓿秋眠性 | 第10页 |
| 1.2.1 苜蓿秋眠性的概念 | 第10页 |
| 1.2.2 苜蓿秋眠性在实际生产中的应用 | 第10页 |
| 1.3 紫花苜蓿转基因研究进展和应用前景 | 第10-12页 |
| 1.3.1 紫花苜蓿转基因发展现状 | 第10-12页 |
| 1.3.1.1 苜蓿耐盐基因的遗传转化 | 第10-11页 |
| 1.3.1.2 苜蓿抗寒、耐热基因的遗传转化 | 第11页 |
| 1.3.1.3 苜蓿抗病虫害基因的遗传转化 | 第11-12页 |
| 1.3.1.4 苜蓿抗除草剂基因的遗传转化 | 第12页 |
| 1.3.2 转基因苜蓿的应用前景 | 第12页 |
| 1.3.2.1 转基因苜蓿的应用前景 | 第12页 |
| 1.3.2.2 转基因苜蓿存在的问题 | 第12页 |
| 1.4 植物基因转化方法 | 第12-14页 |
| 1.4.1 农杆菌介导法 | 第12-13页 |
| 1.4.2 电击法 | 第13页 |
| 1.4.3 基因枪转化法 | 第13-14页 |
| 1.4.4 花粉管通道法 | 第14页 |
| 1.5 热激蛋白（HSP）基因和胰蛋白酶抑制剂（TI）基因研究进展 | 第14-16页 |
| 1.5.1 热激蛋白（HSP）基因研究进展 | 第14-15页 |
| 1.5.1.1 热激蛋白的分类 | 第14页 |
| 1.5.1.2 植物热激蛋白的功能 | 第14-15页 |
| 1.5.1.3 HSP研究存在问题及展望 | 第15页 |
| 1.5.2 胰蛋白酶抑制剂（TI）基因研究进展 | 第15-16页 |
| 1.5.2.1 苜蓿主要虫害 | 第15页 |
| 1.5.2.2 抗虫基因来源 | 第15-16页 |
| 1.6 本实验的目的意义 | 第16-17页 |
| 2 引言 | 第17-18页 |
| 3 试验一紫花苜蓿MSHSP70、MSTI基因的时空表达 | 第18-30页 |
| 3.1 试验材料 | 第18页 |
| 3.1.1 主要试剂 | 第18页 |
| 3.1.2 仪器设备 | 第18页 |
| 3.2 实验方法 | 第18-23页 |
| 3.2.0 采样 | 第18页 |
| 3.2.1 苜蓿总RNA提取 | 第18-19页 |
| 3.2.2 RNA反转录 | 第19-20页 |
| 3.2.3 紫花苜蓿MSHSP70、MSTI基因克隆与测序 | 第20-23页 |
| 3.2.3.1 引物设计与PCR反应 | 第20-21页 |
| 3.2.3.2 PCR产物切胶回收 | 第21-22页 |
| 3.2.3.3 目的片段与T克隆载体的连接 | 第22页 |
| 3.2.3.4 连接产物转化到DH5Α 感受态细胞 | 第22页 |
| 3.2.3.5 重组质粒的菌液PCR检测 | 第22-23页 |
| 3.2.3.6 克隆序列的测序 | 第23页 |
| 3.2.3.7 MSHSP70、MSTI基因荧光定量PCR | 第23页 |
| 3.3 结果 | 第23-28页 |
| 3.3.1 采样时温度和当天光周期 | 第23页 |
| 3.3.2 MSHSP70、MSTI基因片段克隆测序结果 | 第23-25页 |
| 3.3.2.1 植物总RNA提取电泳结果 | 第23-24页 |
| 3.3.2.2 MSHSP70、MSTI基因PCR扩增结果 | 第24页 |
| 3.3.2.3 测序结果比对 | 第24-25页 |
| 3.3.3 MSHSP70、MSTI MRNA在 4、6 和9月份VERNAL紫花苜蓿的根、茎、叶和芽相对表达量分析 | 第25-28页 |
| 3.3.3.1 不同月份MSHSP70MRNA在根、茎、叶和顶芽的表达量 | 第25-27页 |
| 3.3.3.2 MSTIMRNA在4和 6 月份 9 VERNAL紫花苜蓿的根、茎、叶和芽相对表达量分析 | 第27-28页 |
| 3.4 讨论 | 第28-30页 |
| 3.4.1 MSHSP70MRNA的时空表达量 | 第28-30页 |
| 4 试验二农杆菌介导的MSHSP70、MSTI基因转化紫花苜蓿体系的优化和建立 | 第30-40页 |
| 4.1 试验材料 | 第30-32页 |
| 4.1.1 植物材料 | 第30页 |
| 4.1.2 菌株和载体 | 第30页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第30-31页 |
| 4.1.4 仪器设备 | 第31-32页 |
| 4.2 实验方法 | 第32-36页 |
| 4.2.1 植物激素的配制 | 第32页 |
| 4.2.2 抗生素的配制 | 第32页 |
| 4.2.3 培养基配制 | 第32-33页 |
| 4.2.4 过表达载体PCAMBLA3300-35S- MSHSP70-BAR和PCAMBLA3300-35S- MSTI-BAR构建 | 第33-34页 |
| 4.2.4.1 PCAMBLA3300-35S-BAR、PMD18- MSHSP70和PMD18-MSTI质粒的提取 | 第33页 |
| 4.2.4.2 质粒载体PCAMBLA3301-35S-BAR、质粒PMD18- MSHSP70和PMD18-MSTI分别双酶切 | 第33-34页 |
| 4.2.4.3 连接反应 | 第34页 |
| 4.2.4.4 过表达载体PCAMBLA3300-35S- MSHSP70-BAR和PCAMBLA3300-35S- MSTI-BAR的鉴定 | 第34页 |
| 4.2.5 质粒PCAMBLA3300-35S- MSHSP70-BAR的提取和转化农杆菌LBA4404感受态细胞 | 第34页 |
| 4.2.6 无菌苗制备 | 第34页 |
| 4.2.7 农杆菌介导的转化过程 | 第34-35页 |
| 4.2.7.1 预培养时间对转化的影响 | 第34-35页 |
| 4.2.7.2 农杆菌菌液最佳浸染时间的确定 | 第35页 |
| 4.2.7.3 最佳共培养时间的确定 | 第35页 |
| 4.2.7.4 头孢（CEF）浓度的确定 | 第35页 |
| 4.2.7.5 体胚形成时间的确定 | 第35页 |
| 4.2.8 转基因苜蓿的鉴定 | 第35-36页 |
| 4.2.8.1 PCR鉴定法 | 第35-36页 |
| 4.2.8.2 除草剂PPT喷洒法 | 第36页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第36-40页 |
| 4.3.1 过表达载体PCAMBLA3300-35S- MSHSP70-BAR、PCAMBLA3300-35S-MSTI-BAR构建 | 第36-37页 |
| 4.3.1.1 pCAMBLA3300-35S –bar、MsHSP70和MsTI酶切电泳结果 | 第36-37页 |
| 4.3.1.2 过表达载体PCAMBLA3300-35S- MSHSP70-BAR、PCAMBLA3300-35S-MSTI-BAR酶切鉴定 | 第37页 |
| 4.3.2 LBA4404/ PCAMBLA3300-35S- MSHSP70-BAR、LBA4404/ PCAMBLA3300-35S-MSTI-BAR工程菌的获得 | 第37页 |
| 4.3.3 农杆菌介导转化紫花苜蓿体系建立 | 第37-40页 |
| 4.3.3.1 预培养时间对紫花苜蓿转化的影响 | 第38页 |
| 4.3.3.2 农杆菌菌液侵染时间对紫花苜蓿遗传转化的影响 | 第38-39页 |
| 4.3.3.3 共培养时间对紫花苜蓿转化的影响 | 第39页 |
| 4.3.3.4 选择培养基中抑菌抗生素CEF浓度的选择 | 第39-40页 |
| 4.3.3.5 体胚形成时间的确定 | 第40页 |
| 4.3.4 紫花苜蓿工农一号、驯鹿、VERNAL高频再生组培体系的建立 | 第40页 |
| 4.3.5 苜蓿遗传转化体系的建立与优化 | 第40页 |
| 4.3.6 分化新苗玻璃化问题 | 第40页 |
| 5.总结 | 第40-42页 |
| 参考文献 | 第42-50页 |
| ABSTRACT | 第50-51页 |
| 附录 | 第52页 |
