| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-8页 |
| 第一章 绪论 | 第8-22页 |
| ·腈水合酶的研究进展 | 第8-11页 |
| ·腈水合酶的产生菌及其结构 | 第8-9页 |
| ·腈水合酶基因序列的特性 | 第9页 |
| ·腈水合酶以基因簇的形式存在 | 第9-11页 |
| ·腈水合酶基因序列 | 第11页 |
| ·丙烯酰胺的概述 | 第11-14页 |
| ·丙烯酰胺的性质 | 第11页 |
| ·丙烯酸胺的用途 | 第11-13页 |
| ·石油工业中的应用 | 第12页 |
| ·水处理的应用 | 第12-13页 |
| ·造纸工业中的应用 | 第13页 |
| ·采矿、冶金、洗煤工业中的应用 | 第13页 |
| ·丙烯酰胺的市场预期 | 第13-14页 |
| ·生物法生产丙烯酰胺的发展历史 | 第14-15页 |
| ·硫酸水合法 | 第15页 |
| ·铜催化水合法 | 第15页 |
| ·微生物转化法 | 第15页 |
| ·高活性腈水合酶菌株的筛选方法 | 第15-18页 |
| ·微波诱变育种 | 第16-17页 |
| ·基因组重排育种 | 第17-18页 |
| ·腈水合酶基因克隆的研究进展 | 第18-19页 |
| ·克隆腈水合酶基因的常用方法 | 第18页 |
| ·腈水合酶重组蛋白诱导表达的研究进展 | 第18-19页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第19-20页 |
| ·腈水合酶基因研究的发展方向 | 第20-22页 |
| 第二章 诺卡氏菌腈水合酶基因的克隆及表达载体的构建 | 第22-31页 |
| ·引言 | 第22页 |
| ·实验材料 | 第22-24页 |
| ·菌株、质粒 | 第22页 |
| ·试剂 | 第22-23页 |
| ·培养基 | 第23页 |
| ·化学药品 | 第23-24页 |
| ·仪器与设备 | 第24-25页 |
| ·实验方法 | 第25-28页 |
| ·诺卡氏菌总DNA 的提取 | 第25页 |
| ·PCR 扩增腈水合酶基因 | 第25-26页 |
| ·重组质粒pMD-18T-NHase 的构建 | 第26-28页 |
| ·PCR 产物的回收纯化 | 第26-27页 |
| ·载体连接 | 第27页 |
| ·大肠杆菌的生长、维持和保藏 | 第27页 |
| ·CaCI_2 法制备大肠杆菌DH-5α感受态细胞 | 第27页 |
| ·大肠杆菌重組质粒pMD-18T-NHase 的分离 | 第27-28页 |
| ·重組质粒pMD-18T-NHase 的鉴定 | 第28页 |
| ·实验结果 | 第28-30页 |
| ·腈水合酶基因的克隆 | 第28-29页 |
| ·重組质粒pMD-18T-NHase 的鉴定 | 第29-30页 |
| ·重组质粒pGEX-4T-1/NHase 的双酶切鉴定 | 第30页 |
| ·讨论与小结 | 第30-31页 |
| 第三章 GST-NHase 融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定 | 第31-39页 |
| ·引言 | 第31页 |
| ·材料 | 第31-32页 |
| ·药品与试剂 | 第31-32页 |
| ·GST 酶活反应试剂 | 第31-32页 |
| ·蛋白纯化试剂 | 第32页 |
| ·主要仪器 | 第32页 |
| ·方法 | 第32-34页 |
| ·GST-NHase 融合蛋白的诱导表达 | 第32页 |
| ·GST-NHase 融合蛋白的诱导条件的优化 | 第32页 |
| ·GST-NHase 融合蛋白的分离纯化 | 第32-33页 |
| ·GST-NHase 融合蛋白的SDS-PAGE 鉴定 | 第33页 |
| ·GST 酶活测定 | 第33页 |
| ·GST-NHase 融合蛋白的酶切 | 第33页 |
| ·切割后目的蛋白的SDS-PAGE 鉴定 | 第33页 |
| ·腈水合酶酶活的检测 | 第33-34页 |
| ·结果 | 第34-37页 |
| ·GST-NHase 融合蛋白的诱导条件的优化 | 第34-35页 |
| ·GST-NHase 融合蛋白的分离纯化 | 第35-36页 |
| ·GST-NHase 融合蛋白的分离纯化及酶切后的SDS-PAGE 鉴定 | 第36-37页 |
| ·小结 | 第37-39页 |
| 第四章 腈水合酶pET-30c 表达体系的构建 | 第39-46页 |
| ·引言 | 第39页 |
| ·材料 | 第39-40页 |
| ·主要药品与试剂 | 第39-40页 |
| ·主要药品 | 第39页 |
| ·主要试剂 | 第39-40页 |
| ·主要仪器 | 第40页 |
| ·方法 | 第40-44页 |
| ·PCR 扩增腈水合酶基因 | 第40-41页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第41页 |
| ·重组质粒 pET-30C-NHase 的构建 | 第41-43页 |
| ·PCR 产物的回收纯化 | 第41-42页 |
| ·载体连接 | 第42页 |
| ·质粒及目的基因的Hind III 和NdeⅠ双酶切 | 第42页 |
| ·CaC12 法制备大肠杆菌DH5α/BL21 感受态细胞 | 第42-43页 |
| ·连接液的转化 | 第43页 |
| ·大肠杆菌重組质粒pET-30c-NHase 的分离: | 第43页 |
| ·重組质粒pET-30c-NHase 及点突变重组质粒pET-30c-NHase 1的鉴定 | 第43页 |
| ·重组质粒的序列测定 | 第43-44页 |
| ·结果 | 第44-45页 |
| ·以Nde I/Hind III 为酶切位点的窿腈水合酶基因的克隆 | 第44页 |
| ·重组质粒pMD-18T/pMD-18T/NHase的鉴定及引物NHase3/NHase,NHase4/NHase5 的PCR 产物 | 第44-45页 |
| ·重组质粒pMD-18T/NHase I,pet-30c/NHase和pet-30c/NHase I的鉴定 | 第45页 |
| ·小结 | 第45-46页 |
| 第五章 His-NHase 的诱导表达与纯化 | 第46-54页 |
| ·引言 | 第46页 |
| ·材料 | 第46-47页 |
| ·菌种 | 第46页 |
| ·试剂 | 第46-47页 |
| ·细菌培养用试剂 | 第46页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)相关溶液 | 第46-47页 |
| ·蛋白纯化用试剂的配置方法如下 | 第47页 |
| ·主要实验仪器 | 第47页 |
| ·实验方法 | 第47-50页 |
| ·His-NHase 重组菌的表达 | 第47页 |
| ·重组菌BL21-pET-30c | 第47-48页 |
| ·IPTG 浓度的优化 | 第48页 |
| ·His-NHase 及His-NHase I 诱导温度及时间的优化 | 第48页 |
| ·金属螯合载体EPI-30-ARG-IDA-C02+的制备 | 第48-49页 |
| ·His-NHase I 融合蛋白的分离纯化 | 第49页 |
| ·His-NHase 的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第49页 |
| ·腈水合酶酶活的检测 | 第49-50页 |
| ·结果与讨论 | 第50-53页 |
| ·重组菌BL21-pET-30c/NHase诱导温度和IPTG的最佳诱导浓度的确定 | 第50-51页 |
| ·点突变重组菌BL21-pET-30c/NHase诱导温度和IPTG的最佳诱导浓度的确定 | 第51-52页 |
| ·点突变重组菌BL21-pET-30c/NHase I 表达产物的分离纯化 | 第52-53页 |
| ·结论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-58页 |
| 致谢 | 第58页 |
