| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第1章 前言 | 第13-26页 |
| 1.1 真核生物前体mRNA中内含子的剪接机制 | 第13-15页 |
| 1.2 剪接体复合物(Spliceosome)的组成及其复杂性 | 第15-16页 |
| 1.3 影响内含子剪接的主要因素 | 第16-23页 |
| 1.3.1 Pre-mRNA剪接与顺式作用元件的关系 | 第16-17页 |
| 1.3.2 Pre-mRNA剪接所需要的反式作用因子 | 第17-22页 |
| 1.3.3 染色质结构和转录对内含子剪接的影响 | 第22-23页 |
| 1.4 植物内含子与酵母内含子 | 第23页 |
| 1.5 内含子剪接与基因表达 | 第23-25页 |
| 1.6 本课题研究的目标及意义 | 第25-26页 |
| 第2章 材料与方法 | 第26-67页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-38页 |
| 2.1.1 质粒 | 第26-28页 |
| 2.1.2 菌种 | 第28页 |
| 2.1.3 植物材料 | 第28页 |
| 2.1.4 酶及化学试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.5 主要仪器设备 | 第29页 |
| 2.1.6 培养基的配制 | 第29-35页 |
| 2.1.7 试剂的配制 | 第35-38页 |
| 2.1.8 抗体 | 第38页 |
| 2.2 实验方法 | 第38-67页 |
| 2.2.1 生物学软件分析 | 第38页 |
| 2.2.2 引物序列 | 第38-46页 |
| 2.2.3 plasmid shuffling | 第46-47页 |
| 2.2.4 在体外构建拟南芥目的基因点突变 | 第47-48页 |
| 2.2.5 在不额外引入酶切位点的前提下在AcDNA in RS413构建的编码框中插入含不同突变的拟南芥核糖蛋白RPL36B基因第一个内含子的方法 | 第48-50页 |
| 2.2.6 Touchdown PCR反应体系 | 第50-51页 |
| 2.2.7 PCR产物的检测 | 第51页 |
| 2.2.8 PCR产物纯化回收 | 第51-52页 |
| 2.2.9 酶切体系(以NEB为例) | 第52-53页 |
| 2.2.10 酶切产物纯化回收 | 第53页 |
| 2.2.11 目的片段酶切产物与载体的酶连体系(TaKaRa) | 第53-54页 |
| 2.2.12 大肠杆菌DH5α或XL-Blue感受态细胞的制备和转化 | 第54页 |
| 2.2.13 大肠杆菌菌落PCR验证转化结果 | 第54-55页 |
| 2.2.14 大肠杆菌质粒抽提及酶切验证 | 第55-56页 |
| 2.2.15 利用酵母电转化将克隆在酵母表达载体上的一系列构建转入酵母菌 | 第56-57页 |
| 2.2.16 酵母菌落PCR | 第57-58页 |
| 2.2.17 酵母基因组DNA的抽提 | 第58页 |
| 2.2.18 酵母质粒抽提 | 第58-60页 |
| 2.2.19 Spotting assay | 第60页 |
| 2.2.20 酵母总RNA的提取 | 第60-61页 |
| 2.2.21 RNA变性电泳 | 第61-62页 |
| 2.2.22 RT-PCR | 第62-63页 |
| 2.2.23 Western blot | 第63-67页 |
| 第3章 结果与分析 | 第67-99页 |
| 3.1 检查内含子周围的序列是否会影响拟南芥内含子在酵母细胞中的剪接 | 第67-72页 |
| 3.1.1 关于将拟南芥核糖蛋白RPL36B基因一系列突变构建插入拟南芥RPL36B基因cDNA编码框内的构建 | 第67-70页 |
| 3.1.2 RT-PCR检测拟南芥核糖蛋白RPL36B基因一系列突变构建插入拟南芥RPL36B基因cDNA编码框内的剪接情况 | 第70-72页 |
| 3.2 内含子序列组成如GC含量等对剪接效率的影响 | 第72-81页 |
| 3.2.1 不同GC含量的内含子插入到拟南芥第一个内含子位置处的构建 | 第73-75页 |
| 3.2.2 将GC含量不同的内含子5‘ss位点高度保守的碱基G突变成C的构建 | 第75页 |
| 3.2.3 将不同GC含量的内含子BS(Branch site)位点高度保守的两个碱基A分别突变成T和C的构建 | 第75-77页 |
| 3.2.4 用RT-PCR检测不同GC含量的内含子及其突变构建的剪接情况 | 第77-79页 |
| 3.2.5 用Spotting assay检测在不同培养温度下,不同GC含量的内含子及其突变构建的生长情况 | 第79-81页 |
| 3.3 将Yeast promoter+5M+3‘flag+3’UTR in RS413等一系列构建Yeastpromoter换成ADH1 promoter | 第81-85页 |
| 3.3.1 将Yeast promoter+5M+3‘flag+3’UTR in RS413等一系列构建Yeastpromoter换成ADH1 promoter的构建 | 第81-82页 |
| 3.3.2 Spotting assay检测ADH1 promoter+5M+3‘flag+3’UTR in RS413等一系列构建的生长情况 | 第82-84页 |
| 3.3.3 Western Blot检测ADH1 promoter+5M+3‘flag+3’UTR in RS413等一系列构建的蛋白表达情况 | 第84-85页 |
| 3.4 拟南芥U1 snRNA、U2 snRNA对剪接的影响极其相关蛋白P14、SF1和SF3B155的克隆 | 第85-96页 |
| 3.4.1 酵母和拟南芥U1 snRNA、U2 snRNA的克隆 | 第85-90页 |
| 3.4.2 RT-PCR检测拟南芥U1 snRNA和U2 snRNA转录情况 | 第90-91页 |
| 3.4.3 用Spotting assay和RT-PCR检测拟南芥U1 snRNA和U2 snRNA对某些突变菌的生长和剪接的影响 | 第91-92页 |
| 3.4.4 拟南芥P14、SF1和SF3B155的克隆 | 第92-96页 |
| 3.5 研究酵母细胞中多个内含子的剪接情况 | 第96-99页 |
| 3.5.1 酵母细胞多个内含子的构建 | 第96-97页 |
| 3.5.2 RT-PCR检测酵母细胞中多个内含子的剪接情况 | 第97-99页 |
| 第4章 讨论与展望 | 第99-101页 |
| 致谢 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-107页 |
| 附录A 酿酒酵母核糖蛋白RPL36B基因DNA序列(含基因开放阅读框上下游1kb) | 第107-109页 |
| 附录B 拟南芥核糖蛋白RPL36B基因DNA序列(含基因开放阅读框上游2,074bp和下游972 bp) | 第109-111页 |
