| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 目录 | 第10-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-32页 |
| 1.1 大肠杆菌表达系统简介 | 第14页 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统简介 | 第14-15页 |
| 1.3 碱性磷酸酶 | 第15-20页 |
| 1.3.1 概述 | 第15-16页 |
| 1.3.2 大肠杆菌碱性磷酸酶的结构与活性中心 | 第16-17页 |
| 1.3.3 大肠杆菌碱性磷酸酶的催化机制及反应机理 | 第17-18页 |
| 1.3.4 碱性磷酸酶的重组表达研究背景 | 第18-19页 |
| 1.3.5 碱性磷酸酶的应用 | 第19-20页 |
| 1.4 谷氨酸氧化酶 | 第20-26页 |
| 1.4.1 概述 | 第20页 |
| 1.4.2 谷氨酸氧化酶的研究背景 | 第20-22页 |
| 1.4.3 谷氨酸氧化酶的结构 | 第22-24页 |
| 1.4.4 谷氨酸氧化酶的应用 | 第24-26页 |
| 1.5 乙醇氧化酶 | 第26-31页 |
| 1.5.1 概述 | 第26-27页 |
| 1.5.2 醇氧化酶的基因 | 第27页 |
| 1.5.3 醇氧化酶的表达 | 第27-28页 |
| 1.5.4 醇氧化酶活性调控 | 第28-29页 |
| 1.5.5 醇氧化酶的结构 | 第29-30页 |
| 1.5.6 AOX的生物合成过程 | 第30页 |
| 1.5.7 乙醇氧化酶的应用 | 第30-31页 |
| 1.6 本课题拟研究内容 | 第31-32页 |
| 第二章 材料与方法 | 第32-40页 |
| 2.1 质粒与菌株 | 第32页 |
| 2.2 工具酶与主要试剂 | 第32-33页 |
| 2.3 主要仪器 | 第33-34页 |
| 2.4 分子生物学相关操作 | 第34-40页 |
| 2.4.1 分子克隆相关实验 | 第34-36页 |
| 2.4.2 大肠杆菌细胞超声破碎及胞内蛋白提取 | 第36页 |
| 2.4.3 蛋白浓度测定 | 第36页 |
| 2.4.4 SDS-PAGE电泳 | 第36-37页 |
| 2.4.5 Native PAGE | 第37-38页 |
| 2.4.6 Western-blotting | 第38-39页 |
| 2.4.7 毕赤酵母细胞感受态制备 | 第39页 |
| 2.4.8 线性化质粒DNA的电转化方法 | 第39-40页 |
| 第三章 碱性磷酸酶重组、纯化及性质表征 | 第40-54页 |
| 3.1 引言 | 第40页 |
| 3.2 材料与方法 | 第40-41页 |
| 3.2.1 主要试剂与材料 | 第40-41页 |
| 3.3 实验方法 | 第41-44页 |
| 3.3.1 引物设计与基因克隆 | 第41页 |
| 3.3.2 碱性磷酸酶基因片段的获得 | 第41页 |
| 3.3.3 高效表达载体构建 | 第41-42页 |
| 3.3.4 利用基因工程菌表达蛋白 | 第42页 |
| 3.3.5 目标蛋白的纯化 | 第42页 |
| 3.3.6 碱性磷酸酶的活性测定 | 第42-43页 |
| 3.3.7 重组蛋白的酶学性质分析 | 第43-44页 |
| 3.4 结果与分析 | 第44-53页 |
| 3.4.1 碱性磷酸酶编码基因的克隆 | 第44页 |
| 3.4.2 pET28a(+)-AP高效表达载体构建及其诱导表达 | 第44-47页 |
| 3.4.3 重组碱性磷酸酶蛋白纯化 | 第47-48页 |
| 3.4.4 重组碱性磷酸酶的性质表征 | 第48-53页 |
| 3.5 本章总结 | 第53-54页 |
| 第四章 谷氨酸氧化酶重组表达及性质表征 | 第54-70页 |
| 4.1 引言 | 第54页 |
| 4.2 实验材料 | 第54-55页 |
| 4.2.1 菌种及质粒 | 第54页 |
| 4.2.2 酶和培养基 | 第54-55页 |
| 4.3 实验方法 | 第55-58页 |
| 4.3.1 谷氨酸氧化酶编码基因的获得 | 第55-56页 |
| 4.3.2 利用基因工程菌表达蛋白 | 第56-57页 |
| 4.3.3 目标蛋白的纯化 | 第57页 |
| 4.3.4 重组蛋白的蛋白酶改造 | 第57页 |
| 4.3.5 谷氨酸氧化酶的活性测定 | 第57-58页 |
| 4.3.6 酶学性质分析 | 第58页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第58-69页 |
| 4.4.1 pET28a(+)-GOX高效表达载体构建及其诱导表达 | 第58-59页 |
| 4.4.2 重组蛋白的表达 | 第59页 |
| 4.4.3 蛋白纯化 | 第59-60页 |
| 4.4.4 重组谷氨酸氧化酶的蛋白酶改造 | 第60-67页 |
| 4.4.5 谷氨酸氧化酶酶学性质研究 | 第67-69页 |
| 4.5 本章小结 | 第69-70页 |
| 第五章 乙醇氧化酶克隆表达及性质表征 | 第70-91页 |
| 5.1 引言 | 第70页 |
| 5.2 实验试剂与方法 | 第70-71页 |
| 5.2.1 实验试剂 | 第70-71页 |
| 5.3 实验方法 | 第71-77页 |
| 5.3.1 毕赤酵母基因组提取 | 第71页 |
| 5.3.2 引物设计 | 第71-72页 |
| 5.3.3 乙醇氧化酶基因的获得 | 第72页 |
| 5.3.4 乙醇氧化酶表达载体构建 | 第72-73页 |
| 5.3.5 重组质粒线性化 | 第73页 |
| 5.3.6 带乙醇氧化酶高拷贝基因的菌种筛选 | 第73页 |
| 5.3.7 阳性克隆的诱导表达 | 第73页 |
| 5.3.8 乙醇氧化酶蛋白的Westernblot印迹分析 | 第73-74页 |
| 5.3.9 乙醇氧化酶的活力测定 | 第74页 |
| 5.3.10 乙醇氧化酶表达条件优化 | 第74-75页 |
| 5.3.11 乙醇氧化酶的纯化 | 第75页 |
| 5.3.12 重组蛋白的酶学性质分析 | 第75-77页 |
| 5.4 实验结果与讨论 | 第77-90页 |
| 5.4.1 乙醇氧化酶基因的获得 | 第77页 |
| 5.4.2 pPIC9K-AOX表达载体构建 | 第77-78页 |
| 5.4.3 重组乙醇氧化酶在毕赤酵母胞内及胞外的表达情况 | 第78页 |
| 5.4.4 重组AOX表达的培养条件优化 | 第78-80页 |
| 5.4.5 重组AOX表达的诱导条件优化 | 第80-83页 |
| 5.4.6 重组乙醇氧化酶的纯化 | 第83-90页 |
| 5.5 本章小结 | 第90-91页 |
| 第六章 结论与展望 | 第91-94页 |
| 6.1 结论 | 第91-92页 |
| 6.2 课题展望 | 第92-94页 |
| 参考文献 | 第94-104页 |
| 作者简历 | 第104页 |
| 教育背景 | 第104页 |
| 攻读硕士学位论文期间主要科研成果 | 第104页 |
| 专利 | 第104页 |
