| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略语 | 第14-15页 |
| 第一部分 文献综述与实验设计 | 第15-32页 |
| 第一章 背景综述 | 第16-29页 |
| 第一节 膜蛋白研究的困难 | 第16-17页 |
| 第二节 昆虫杆状病毒表达载体系统的研究进展 | 第17-23页 |
| 1 杆状病毒的形态和结构 | 第17-18页 |
| 2 杆状病毒表达系统 | 第18-22页 |
| 2.1 杆状病毒表达系统与大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞三种表达系统比较 | 第19页 |
| 2.2 家蚕/BmNPV表达系统相对于Sf细胞/AcMNPV表达系统的优势 | 第19-20页 |
| 2.3 大肠杆菌一昆虫细胞穿梭载体系统(Bac-to-Bac) | 第20-21页 |
| 2.4 杆状病毒表达系统的进展及展望 | 第21-22页 |
| 3 多角体蛋白 | 第22-23页 |
| 第三节 Bax inhibitor-1的研究进展 | 第23-29页 |
| 1 BI-1基因的发现及分子结构 | 第23-24页 |
| 2 BI-1的表达与分布及进化保守性 | 第24-25页 |
| 3 BI-1的功能 | 第25-28页 |
| 3.1 BI-1的抗凋亡功能 | 第25-27页 |
| 3.2 BI-1的离子通道功能 | 第27页 |
| 3.3 BI-1在植物中的作用 | 第27页 |
| 3.4 BI-1与发育 | 第27-28页 |
| 4 BI-1基因与肿瘤 | 第28页 |
| 5 展望 | 第28-29页 |
| 第二章 实验方案设计 | 第29-32页 |
| 1 实验目的和意义 | 第29-30页 |
| 2 研究内容 | 第30-31页 |
| 3 实验流程图 | 第31-32页 |
| 第二部分 研究论文 | 第32-87页 |
| 第一章 天然Polh的纯化及多克隆抗体的制备 | 第33-43页 |
| 1 材料与试剂 | 第33-34页 |
| 1.1 材料 | 第33页 |
| 1.2 试剂 | 第33页 |
| 1.3 试剂配制 | 第33-34页 |
| 2 方法 | 第34-38页 |
| 2.1 细胞培养与冻存、复苏 | 第34-35页 |
| 2.2 病毒的扩增培养 | 第35页 |
| 2.3 病毒滴度测定(终点稀释法) | 第35-36页 |
| 2.4 天然Polh的纯化 | 第36-37页 |
| 2.5 SDS-PAGE电泳分析 | 第37页 |
| 2.6 Polh多克隆抗体的制备 | 第37-38页 |
| 2.7 Western blotting检测 | 第38页 |
| 3 结果 | 第38-42页 |
| 3.1 天然Polh的粗纯结果 | 第38-39页 |
| 3.2 过RESOUCE Q进一步纯化 | 第39-40页 |
| 3.3 过HiPrep26/10脱盐柱交换缓冲液 | 第40页 |
| 3.4 质谱分析 | 第40-41页 |
| 3.5 Western blotting检测 | 第41-42页 |
| 4 讨论 | 第42-43页 |
| 第二章 快速高效的纯化与Polh融合的目标蛋白方法的建立 | 第43-61页 |
| 1 材料和试剂 | 第43-46页 |
| 1.1 材料 | 第43页 |
| 1.2 试剂 | 第43页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第43-46页 |
| 2 方法 | 第46-53页 |
| 2.1 克隆实验设计 | 第46-47页 |
| 2.2 Polh基因的克隆 | 第47-50页 |
| 2.3 EGFP基因的克隆 | 第50-51页 |
| 2.4 序列测定 | 第51页 |
| 2.5 重组质粒的转化及鉴定 | 第51页 |
| 2.6 重组质粒在大肠杆菌中表达 | 第51页 |
| 2.7 SDS-PAGE电泳分析 | 第51页 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 | 第51-52页 |
| 2.9 TEV酶酶切纯化后的融合蛋白 | 第52页 |
| 2.10 TEV酶酶切后EGFP的纯化 | 第52-53页 |
| 2.11 Western blotting分析酶切后各组份 | 第53页 |
| 3 结果 | 第53-59页 |
| 3.1 Polh基因的克隆结果 | 第53-54页 |
| 3.2 EGFP基因的克隆结果 | 第54-55页 |
| 3.3 序列测定 | 第55页 |
| 3.4 Polh-EGFP的诱导表达 | 第55-56页 |
| 3.5 Polh-EGFP的纯化 | 第56-58页 |
| 3.6 融合蛋白的TEV酶酶切 | 第58页 |
| 3.7 TEV酶酶切后EGFP的纯化 | 第58-59页 |
| 3.8 Western blotting分析酶切后各蛋白 | 第59页 |
| 4 讨论 | 第59-61页 |
| 第三章 家蚕Bax inhibitor-1基因的生物信息学分析 | 第61-68页 |
| 1 序列与工具 | 第61页 |
| 1.1 序列 | 第61页 |
| 1.2 工具和软件 | 第61页 |
| 2 方法 | 第61-62页 |
| 2.1 BmBI-1基因的获得 | 第61页 |
| 2.2 BmBI-1基因的序列分析 | 第61-62页 |
| 3 结果 | 第62-66页 |
| 3.1 BmBI-1基因的序列 | 第62页 |
| 3.2 疏水性分析 | 第62-63页 |
| 3.3 跨膜区和信号肽分析 | 第63-64页 |
| 3.4 二级结构的预测 | 第64-65页 |
| 3.5 BmBI-1蛋白高级结构的预测 | 第65页 |
| 3.6 功能位点分析 | 第65页 |
| 3.7 BmBI-1氨基酸序列同源性分析 | 第65-66页 |
| 4 讨论 | 第66-68页 |
| 第四章 家蚕Bax inhibitor-1基因融合Polh基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 | 第68-87页 |
| 1 材料与试剂 | 第68-69页 |
| 1.1 材料 | 第68页 |
| 1.2 试剂 | 第68页 |
| 1.3 试剂配制 | 第68-69页 |
| 2 方法 | 第69-77页 |
| 2.1 重组质粒pFastBac HTb-Polh的构建 | 第69-70页 |
| 2.2 重组供体质粒pFastBac HTb-Polh-BmBI-1与pFastBac HTb-BmBI-1的构建及鉴定 | 第70-72页 |
| 2.3 重组病毒基因组Bacmid-Polh-BmBI-1与Bacmid-BmBI-1的构建 | 第72-74页 |
| 2.4 细胞培养与冻存、复苏 | 第74页 |
| 2.5 重组病毒vBmPolh-BmBI-1与vBmBmBI-1的构建 | 第74-75页 |
| 2.6 目的蛋白Polh-BmBI-1和BmBI-1在家蚕BmN细胞中的表达和鉴定 | 第75-76页 |
| 2.7 融合蛋白Polh-BmBI-1在重组病毒感染的细胞中的表达时相 | 第76-77页 |
| 2.8 融合蛋白Polh-BmBI-1在家蚕五龄幼虫及蚕蛹中的表达和鉴定 | 第77页 |
| 3 结果 | 第77-85页 |
| 3.1 重组供体质粒pFastBac HTb-Polh-BmBI-1与pFastBac HTb-BmBI-1的 | 第77-79页 |
| 3.2 重组Bacmid PCR鉴定 | 第79-80页 |
| 3.3 重组病毒vBmPolh-BmBI-1与vBmBmBl-1的PCR鉴定 | 第80页 |
| 3.4 PT-PCR及Western blotting鉴定Polh-BmBI-1和BmBI-1蛋白在家蚕细胞中的表达情况 | 第80-83页 |
| 3.5 融合蛋白Polh-BmBI-1在重组病毒感染的细胞中的表达时相 | 第83-84页 |
| 3.6 Western blotting鉴定融合蛋白Polh-BmBI-1在家蚕幼虫及蚕蛹中的表达 | 第84-85页 |
| 4 讨论 | 第85-87页 |
| 结论 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
