| 摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8页 |
| 第一部分 文献综述与实验设计 | 第14-27页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-23页 |
| 引言 | 第15页 |
| 1 杆状病毒多角体蛋白概述 | 第15-17页 |
| 2 杆状病毒表达系统研究进展 | 第17-20页 |
| 3 Reeler保守结构域 | 第20-21页 |
| 3.1 Reeler保守结构域介绍 | 第20页 |
| 3.2 Reelin信号转导通路 | 第20-21页 |
| 4 研究现状和展望 | 第21-23页 |
| 第二章 实验方案设计 | 第23-27页 |
| 1 研究的目的和意义 | 第23页 |
| 2 研究内容 | 第23-24页 |
| 3 实验流程 | 第24-27页 |
| 3.1 家蚕BmIRP蛋白融合多角体原核表达与纯化 | 第24-25页 |
| 3.2 BmIRP基因融合Polh基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 | 第25页 |
| 3.4 基因干扰技术对BmIRP功能的初步研究 | 第25-26页 |
| 3.5 BmIRP基因在家蚕组织中的转录差异分析 | 第26-27页 |
| 第二部分 研究内容 | 第27-90页 |
| 第三章 生物信息学分析 | 第28-38页 |
| 1 生物信息学工具 | 第28页 |
| 2 方法 | 第28-29页 |
| 3 结果 | 第29-37页 |
| 3.1 家蚕BmIRP基因序列 | 第29-30页 |
| 3.2 保守结构域分析 | 第30页 |
| 3.3 磷酸化位点分析 | 第30-31页 |
| 3.4 疏水性分析 | 第31页 |
| 3.5 跨膜区预测 | 第31-32页 |
| 3.6 信号肽分析 | 第32-33页 |
| 3.7 二级结构预测 | 第33页 |
| 3.8 三级结构预测 | 第33-34页 |
| 3.9 BmIRP蛋白的功能位点预测 | 第34页 |
| 3.10 氨基酸序列同源性分析 | 第34-35页 |
| 3.11 进化树的构建 | 第35-36页 |
| 3.12 电子表达谱预测 | 第36页 |
| 3.13 BmIRP蛋白细胞内定位分析 | 第36-37页 |
| 4 讨论 | 第37-38页 |
| 第四章 多角体融合蛋白Polh-BmIRP的原核表达与纯化 | 第38-63页 |
| 1 材料与试剂 | 第38-42页 |
| 1.1 材料 | 第38页 |
| 1.2 试剂 | 第38页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第38-42页 |
| 2 方法 | 第42-52页 |
| 2.1 重组pET-28a-Polh质粒的构建 | 第42-46页 |
| 2.2 原核重组表达载体pET-28a-Polh-BmIRP的构建 | 第46-48页 |
| 2.3 原核表达融合蛋白Polh-BmIRP | 第48-51页 |
| 2.4 表达产物Polh-BmIRP融合蛋白的纯化 | 第51页 |
| 2.5 Bradford法定量 | 第51-52页 |
| 2.6 质谱鉴定融合蛋白Polh-BmIRP | 第52页 |
| 2.7 扫描电镜下观察融合蛋白 | 第52页 |
| 3. 结果 | 第52-61页 |
| 3.1 Polh基因扩增结果 | 第52-53页 |
| 3.2 重组pET-28a-Polh的构建 | 第53-54页 |
| 3.3 BmIRP基因扩增结果 | 第54页 |
| 3.4 重组表达载体pET-28a-Polh-BmIRP的构建 | 第54-55页 |
| 3.5 重组表达载体pET-28a-BmIRP的构建 | 第55-56页 |
| 3.6 重组质粒pET-28a-Polh-BmIRP及pET-28a-BmIRP的序列测定 | 第56页 |
| 3.7 重组pET-28a-Polh-BmIRP及pET-28a-BmIRP转化E.coli BL21诱导表达 | 第56-57页 |
| 3.8 Western blotting鉴定融合蛋白表达 | 第57页 |
| 3.9 重组表达产物Polh-BmIRP的纯化 | 第57-59页 |
| 3.10 蛋白含量测定 | 第59-60页 |
| 3.11 MALDI-TOF-MS鉴定融合蛋白 | 第60页 |
| 3.12 扫描电镜下观察融合蛋白Polh-BmIRP结构 | 第60-61页 |
| 4 讨论 | 第61-63页 |
| 第五章 融合蛋白Polh-BmIRP的晶体培养 | 第63-68页 |
| 1 实验材料及设备 | 第63页 |
| 2 实验方法 | 第63-66页 |
| 2.1 蛋白样品的处理 | 第63-64页 |
| 2.2 盖玻片的预处理 | 第64-65页 |
| 2.3 晶体培养 | 第65页 |
| 2.4 晶体观测 | 第65-66页 |
| 3 结果 | 第66-67页 |
| 4 讨论 | 第67-68页 |
| 第六章 多角体融合蛋白Polh-BmIRP的真核表达 | 第68-79页 |
| 1 材料与试剂 | 第68页 |
| 1.1 材料 | 第68页 |
| 1.2 主要试剂 | 第68页 |
| 2. 方法 | 第68-75页 |
| 2.1 重组转移载体pFastBac HTb-Polh-BmIRP的构建 | 第68-69页 |
| 2.2 重组Bacmid-Polh-BmIRP质粒的构建 | 第69-72页 |
| 2.3 家蚕BmN细胞培养 | 第72-73页 |
| 2.4 脂质体转染家蚕卵巢上皮细胞BmN | 第73-74页 |
| 2.5 重组Bacmid病毒的鉴定 | 第74页 |
| 2.6 病毒滴度测定 | 第74页 |
| 2.7 病毒的扩增培养 | 第74页 |
| 2.8 融合蛋白在家蚕BmN细胞中的表达和鉴定 | 第74-75页 |
| 3 结果 | 第75-78页 |
| 3.1 重组pFastBac HTb-Polh-BmIRP质粒鉴定 | 第75页 |
| 3.2 重组Bacmid质粒鉴定 | 第75-76页 |
| 3.3 融合蛋白Polh-BmIRP的真核表达 | 第76-78页 |
| 4 讨论 | 第78-79页 |
| 第七章 BmIRP 基因的RNAi对家蚕培养细胞生物活性及细胞周期的影响 | 第79-86页 |
| 1 材料与试剂 | 第79-80页 |
| 1.1 材料与设备 | 第79页 |
| 1.2 试剂 | 第79页 |
| 1.3 试剂的配制 | 第79-80页 |
| 2 方法 | 第80-83页 |
| 2.1 dsRNA的合成 | 第80-81页 |
| 2.2 RNAi----dsRNA的转染 | 第81-82页 |
| 2.3 MTT检测BmIRP基因沉默后家蚕BmN细胞的生物活性 | 第82-83页 |
| 2.4 流式细胞仪检测 | 第83页 |
| 3 结果 | 第83-85页 |
| 3.1 dsRNA的合成 | 第83-84页 |
| 3.2 BmIRP RNAi的MTT检测结果分析 | 第84页 |
| 3.3 流式细胞仪检测 | 第84-85页 |
| 4 讨论 | 第85-86页 |
| 第八章 荧光定量PCR分析BmIRP基因在家蚕组织中的转录水平 | 第86-90页 |
| 1 材料与试剂 | 第86页 |
| 1.1 主要材料和仪器 | 第86页 |
| 1.2 主要试剂 | 第86页 |
| 2 方法 | 第86-88页 |
| 2.1 家蚕五龄幼虫组织的提取 | 第86页 |
| 2.2 各组织总RNA提取 | 第86-87页 |
| 2.3 DNA酶处理总RNA | 第87页 |
| 2.4 cDNA第一链的合成 | 第87页 |
| 2.5 荧光定量PCR分析 | 第87-88页 |
| 3 结果与讨论 | 第88-90页 |
| 结论 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-97页 |
| 致谢 | 第97页 |
