| 摘要 | 第6-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 前言 | 第13-18页 |
| 第一部分 CRISPR-Cas9-TCRAC系统的构建及功能检测 | 第18-35页 |
| 引言 | 第18页 |
| 1 实验材料 | 第18-20页 |
| 1.1 菌株及细胞 | 第18页 |
| 1.2 试剂 | 第18-19页 |
| 1.3 实验仪器 | 第19-20页 |
| 2 实验方法 | 第20-28页 |
| 2.1 TRAC的sgRNA的设计及其寡核苷酸序列的合成 | 第20页 |
| 2.2 pX458-gRNA的质粒的构建 | 第20-23页 |
| 2.2.1 gRNA核心片段site1、site2、site3双链DNA的制备 | 第20-21页 |
| 2.2.2 pX458-site1、pX458-site2、pX458-site3的构建及序列鉴定。 | 第21-23页 |
| 2.3 pX458-TCRαC敲除质粒功能的验证 | 第23-26页 |
| 2.3.1 pX458-TCRαC转染 293T细胞 | 第23页 |
| 2.3.2 检测荧光蛋白表达情况 | 第23-24页 |
| 2.3.3 流式细胞术检测转染效率以及基因组DNA的提取 | 第24页 |
| 2.3.4 PCR方法扩增基因组DNA和PCR产物测序 | 第24-25页 |
| 2.3.5 PCR产物T载体连接、测序 | 第25-26页 |
| 2.4 gRNA的脱靶检测 | 第26-28页 |
| 3 结果 | 第28-33页 |
| 3.1 pX458-TCRαC敲除质粒的构建 | 第28-29页 |
| 3.2 检测pX458-site1、pX458-site2、pX458-site3质粒对细胞的转染情况 | 第29-31页 |
| 3.3 pX458-site1、pX458-site2、pX458-site3对 293T细胞系的敲除效率的验证 | 第31-32页 |
| 3.4 敲除质粒的脱靶性的考察 | 第32-33页 |
| 4 讨论 | 第33-34页 |
| 5 小结 | 第34-35页 |
| 第二部分 不同细胞系的基因编辑效率及NHEJ修复相关基因的表达水平差异 | 第35-58页 |
| 引言 | 第35页 |
| 1 实验材料 | 第35-36页 |
| 1.1 菌株及细胞 | 第35页 |
| 1.2 实验试剂及引物 | 第35页 |
| 1.3 实验仪器 | 第35-36页 |
| 2 方法 | 第36-44页 |
| 2.1 CRISPR-Cas9系统对几种不同类型人源细胞的基因编辑情况考察 | 第36-40页 |
| 2.1.1 pX458-site2菌种扩增和去内毒素质粒提取 | 第36-37页 |
| 2.1.2 细胞系的转染 | 第37页 |
| 2.1.3 检测各组细胞绿色荧光蛋白的表达情况 | 第37页 |
| 2.1.4 流式细胞术检测转染效率以及基因组DNA的提取 | 第37-38页 |
| 2.1.5 PCR方法扩增基因组DNA和PCR产物测序 | 第38-39页 |
| 2.1.6 PCR产物T载体连接、测序 | 第39-40页 |
| 2.2 不同类型人源细胞NHEJ修复相关基因的表达检测 | 第40-44页 |
| 2.2.1 细胞系的总RNA提取 | 第40页 |
| 2.2.2 根据RNA反转录合成cDNA | 第40-42页 |
| 2.2.3 各组细胞的修复基因的考察 | 第42-44页 |
| 2.2.4 统计学分析 | 第44页 |
| 3 结果 | 第44-55页 |
| 3.1 CRISPR-Cas9系统对几种不同类型人源细胞的基因编辑情况考察 | 第44-46页 |
| 3.1.1 pX458-site2菌种扩增和去内毒素质粒提取 | 第44-45页 |
| 3.1.2 pX458-site2对 293、Hela、SW480的转染效率 | 第45-46页 |
| 3.2 pX458-site2质粒对各组细胞的敲除情况的考察 | 第46-49页 |
| 3.2.1 基因组DNA的提取和PCR扩增 | 第46-47页 |
| 3.2.2 各组PCR产物的测序分析及细胞编辑情况的考察 | 第47-49页 |
| 3.3 不同类型人源细胞NHEJ修复相关基因的表达检测 | 第49-55页 |
| 3.3.1 不同细胞的RNA的提取 | 第49页 |
| 3.3.2 各组细胞系的cDNA浓度的调节 | 第49页 |
| 3.3.3 普通RT-PCR检测各组细胞的基因结果的分析 | 第49-53页 |
| 3.3.4 荧光定量PCR验证部分基因的表达情况 | 第53-55页 |
| 4 讨论 | 第55-57页 |
| 5 小结 | 第57-58页 |
| 第三部分 CRISPR-Cas9系统腺病毒穿梭质粒载体的构建 | 第58-76页 |
| 引言 | 第58页 |
| 1 实验材料 | 第58-59页 |
| 1.1 实验样本 | 第58页 |
| 1.2 实验试剂 | 第58-59页 |
| 1.3 仪器 | 第59页 |
| 2 方法 | 第59-68页 |
| 2.1 细菌的扩增及pX330和pDC315质粒提取 | 第59-63页 |
| 2.1.1 pX330和pDC315菌种的扩增 | 第59页 |
| 2.1.2 pX330和pDC315质粒的提取 | 第59-60页 |
| 2.1.3 过渡质粒pEGE-T-U6+gRNA质粒的构建 | 第60-62页 |
| 2.1.4 质粒的酶切及pDC315-U6+gRNA的构建 | 第62-63页 |
| 2.1.5 连接后质粒转化及序列鉴定 | 第63页 |
| 2.2 pDC315-Cas9载体的构建 | 第63-68页 |
| 3 结果 | 第68-74页 |
| 3.1 pDC315-U6+gRNA质粒的构建 | 第68-71页 |
| 3.1.1 过渡质粒pEGE-T-U6+gRNA质粒的构建 | 第68-69页 |
| 3.1.2 pDC315-U6+gRNA质粒的构建 | 第69-71页 |
| 3.2 pDC315-Cas9、Cas9-pDC315质粒的构建 | 第71-74页 |
| 4 讨论 | 第74-75页 |
| 5 小结 | 第75-76页 |
| 结论与展望 | 第76-78页 |
| 参考文献 | 第78-88页 |
| 附录一 英文缩略词表 | 第88-89页 |
| 附录二 质粒图谱 | 第89-91页 |
| 致谢 | 第91页 |
