靶向Apollon真核表达载体联合川芎嗪对K562细胞增殖、凋亡和药物敏感性的影响

【摘要】：目的：筛选有效靶向Apollon小干扰RNA (small interference, siRNA)序列并构建pGPHI-GFP-Neo-Apollon真核载体,研究siRNA沉默Apollon基因联合川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)对人慢性粒细胞白血病细胞株K562增殖、凋亡及对化疗药物敏感性的影响,探索靶向沉默Apollon基因联合中药治疗白血病的新思路。方法：1.将设计合成的Apollon siRNA序列转染人乳腺癌MCF-7细胞,采用RT-PCR、细胞免疫荧光结合激光共聚焦技术、MTT筛选出沉默效率最佳的Apollon siRNA序列,构建pGPHI-GFP-Neo-Apollon特异性真核表达载体。2. pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体稳定转染K562细胞后,RT-PCR检测Apollon mRNA表达水平；细胞免疫荧光结合激光共聚焦技术分析Apollon蛋白的表达量的变化；MTT及FCM法分别检测Apollon siRNA或联合中药TMP后K562细胞对化疗药物长春新碱(vincristine,VCR)和柔红霉素(daunorubicin, DNR)的敏感性及凋亡率的变化。结果：1.设计合成的siRNA 中 siRNA2抑制Apollon基因表达最显著,Apollon mRNA抑制率(inhibitory rate, IR)达(67.308±7.686)%, Apollon蛋白表达为(14.97±2.08)%,细胞增殖抑制率达(73.361±2.118)%；酶切鉴定及测序显示pGPHI/GFP/Neo-Apollon真核表达载体构建成功。2. pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体能在K562细胞内稳定表达,其Apollon mRNA及蛋白的相对表达量分别为(27.622±0.057)%、(15.96±1.71)%,对细胞增值抑制率IR=(63.1±6.3)%,细胞凋亡率达(16.513±1.060)%,与细胞对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。3.pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体稳定转染K562细胞后其对VCR、DNR的敏感性增加,凋亡率分别为(57.200±0.066)%、(50.861±1.893)%,半数抑制浓度(half inhibitory concentration, IC50)明显低于细胞对照组(P0.05)；稳转细胞加入中药TMP后增殖抑制率IR达(80.1±6.5)%,与RNA干扰组、TMP+RNA干扰组比较差异有统计学意义(P0.05)；稳定转染细胞联合不同浓度TMP能不同程度地降低VCR和DNR等化疗药物作用K562细胞的IC50值,且有浓度依赖性,TMP浓度为320μg/mL对VCR和DNR的逆转倍数分别为3.477、2.885,而与细胞对照组及阴性对照组细胞的IC50值差异比较有统计学意义(P0.05)。结论：1.筛选出的靶向Apollon基因siRNA2序列能有效沉默Apollon基因的表达,也能抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖。2.成功构建pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体,重组载体能有效沉默Apollon基因表达,也能显著抑制K562细胞增殖并促进凋亡。3.稳定表达pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体的K562细胞对VCR、DNR的敏感性增强,细胞凋亡率增加；4.稳定转染细胞联合中药TMP后,K562细胞对VCR、DNR敏感性显著增强,IC50值明显降低,明显促进细胞凋亡。
【关键词】：Apollon siRNA 药物 白血病 K562细胞
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R733.7