靶向RNA干扰H0XA7对白血病细胞株U973增殖、凋亡及多药耐药影响的研究

【摘要】：目的：筛选高效沉默同源盒基因A7 (homeobox gene, HOXA7)的小干扰RNA (small interfere RNA, siRNA),构建特异性pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7表达载体,运用RNA干扰技术沉默H0XA7基因,研究抑制HOXA7表达对白血病细胞株U937增殖、凋亡及多药耐药的影响,为白血病基因治疗及逆转多药耐药奠定实验基础。方法：1.根据HOXA7基因序列的不同位点,靶向设计三对siRNA,转染肺腺癌细胞株LETP-a-2, Western blot、RT-PCR法检测每对siRNA对HOXA7表达的抑制作用,筛选出高效沉默HOXA7的siRNA。2.设计并构建特异性沉默HOXA7的表达载体pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7,采用酶切电泳法、测序法进行重组质粒载体鉴定；载体转染U937细胞再进行MTT法、流式细胞术检测沉默HOXA7后U937细胞增殖、凋亡的变化。3. pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7载体转染U937细胞,G418进行筛选,获得稳定沉默HOXA7的U937细胞株,RT-PCR、Western blot法检测HOXA7在基因及蛋白水平的表达；MTT法、流式细胞术分别检测沉默HOXA7后U937细胞对化疗药物阿糖胞苷(Ara-C)、高三尖杉酯碱(HHT)、甲氨蝶呤(MTX)敏感性的变化。结果：1.筛选出高效沉默HOXA7的siRNA2序列,该siRNA2在基因和蛋白水平对HOXA7的抑制率为(57.344±4.743)%、(52.219±0.550)%,均显著高于siRNA1、 siRNA3组,差异有统计学意义(P0.05)。2.成功构建靶向HOXA7的特异性表达载体pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7,酶切及测序证实有效序列插入重组质粒载体；pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7载体转染U937细胞,72h细胞增殖抑制率为(52.617±9.292)%,48h细胞凋亡率为(24.677±4.161)%,与对照组相比均显著增加,差异有统计学意义(P0.05)。3. pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7载体稳定转染U937细胞后,HOXA7在mRNA及蛋白水平的相对表达量分别为(23.910±1.662)%和(25.980±1.651)%,均低于对照组,差异有统计学意义(P0.05); Ara-C、HHT对U937细胞的半数抑制浓度分别低于对照组3.5倍和8.5倍,细胞的凋亡率达(70.101±4.925)%、(78.636±5.993)%,与对照组相比,有统计学差异(P0.05); RNAi+MTX组细胞凋亡率及增殖抑制率均高于RNAi组或MTX组,差异也有统计学意义(P0.05)。结论：1.筛选出高效沉默HOXA7基因的siRNA2,为后续实验奠定基础；2.成功构建靶向沉默HOXA7的特异性pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7表达载体,该载体能有效抑制U937细胞增殖也能促进凋亡；3. pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7载体能高效抑制HOXA7表达,并且能提高U937细胞对Ara-C、HHT、MTX的敏感性,有望逆转白血病多药耐药。
【关键词】：HOXA7 白血病 U937细胞 药物 RNA干扰
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R733.7