嗜盐α-淀粉酶的克隆表达及嗜盐机制的探究
| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 第一章 前言 | 第12-25页 |
| ·α-淀粉酶 | 第12-13页 |
| ·α-淀粉酶概述 | 第12页 |
| ·α-淀粉酶的结构特点 | 第12页 |
| ·α-淀粉酶的性质 | 第12页 |
| ·α-淀粉酶的应用 | 第12-13页 |
| ·嗜盐菌和嗜盐酶 | 第13-21页 |
| ·概述 | 第13页 |
| ·嗜盐菌产生和分布 | 第13-14页 |
| ·嗜盐微生物的分类 | 第14页 |
| ·嗜盐微生物的嗜盐机制 | 第14-15页 |
| ·嗜盐菌的特性 | 第15-16页 |
| ·嗜盐酶分子结构基础研究进展 | 第16-18页 |
| ·嗜盐菌的应用 | 第18-20页 |
| ·嗜盐性α-淀粉酶 | 第20-21页 |
| ·酶分子的改造 | 第21-22页 |
| ·酶分子的基因克隆 | 第22页 |
| ·酶分子的定向进化以及改造 | 第22页 |
| ·融合酶和融合蛋白 | 第22页 |
| ·研究依据和意义 | 第22-24页 |
| ·实验技术路线 | 第24-25页 |
| 第二章 材料和方法 | 第25-34页 |
| ·材料 | 第25页 |
| ·菌株和质粒 | 第25页 |
| ·主要酶和化学试剂 | 第25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·仪器与设备 | 第25页 |
| ·实验方法和步骤 | 第25-34页 |
| ·弗氏柠檬酸杆菌的培养 | 第25-26页 |
| ·C.freundii总DNA的提取 | 第26页 |
| ·信号肽预测 | 第26页 |
| ·f2的重组子的构建 | 第26-27页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第27页 |
| ·制备质粒DNA | 第27页 |
| ·酶切与连接 | 第27页 |
| ·重组质粒的转化 | 第27-28页 |
| ·重组质粒的验证 | 第28-29页 |
| ·菌体PCR验证 | 第28-29页 |
| ·酶切验证重组质粒 | 第29页 |
| ·嗜盐淀粉酶基因的诱导表达 | 第29页 |
| ·镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白 | 第29-30页 |
| ·目的蛋白SDS-聚丙嫌酷胺凝胶电泳 | 第30页 |
| ·目的蛋白Native-PAGE | 第30页 |
| ·标准曲线的测定 | 第30-32页 |
| ·重组淀粉酶酶活力的测定 | 第32页 |
| ·嗜盐淀粉酶酶学性质的研究 | 第32页 |
| ·HPLC对嗜盐淀粉酶水解淀粉的产物分析 | 第32页 |
| ·嗜盐淀粉酶耐盐性性质机理的探究 | 第32-34页 |
| 第三章 结果与分析 | 第34-61页 |
| ·F-2的克隆表达 | 第34-48页 |
| ·C.freundii总DNA的制备 | 第34页 |
| ·F-2的信号肽预测 | 第34-35页 |
| ·f2的克隆 | 第35-36页 |
| ·pSE380-f2重组质粒的琼脂糖凝胶电泳验证 | 第36-37页 |
| ·重组质粒pSE380-f2 | 第37页 |
| ·PCR验证重组质粒pSE380-f2 | 第37页 |
| ·双酶切验证重组质粒pSE380-f2 | 第37页 |
| ·f2的表达及纯化 | 第37-39页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第37-38页 |
| ·Native-PAGE | 第38-39页 |
| ·F2的酶学性质 | 第39-48页 |
| ·不同溶液中F2的酶活情况 | 第39-40页 |
| ·F2的最适温度 | 第40页 |
| ·F2的最适pH的测定 | 第40-41页 |
| ·F2的最适NaCL浓度 | 第41-42页 |
| ·NaCl以及热激对F2酶活力的影响 | 第42页 |
| ·不同缓冲液下F2的酶活情况 | 第42-43页 |
| ·F2的热稳定性的测定 | 第43页 |
| ·pH对F2稳定性的影响 | 第43-44页 |
| ·EDTA对F2酶活性的影响 | 第44-45页 |
| ·Ca~(2+)对F2稳定性的影响 | 第45页 |
| ·金属离子对F2酶活性的影响 | 第45-46页 |
| ·F2的底物特异性 | 第46页 |
| ·HPLC对重组酶F2水解的淀粉产物分析 | 第46-47页 |
| ·F2的比活力的测定 | 第47页 |
| ·F2的Vmax和Km值 | 第47-48页 |
| ·K6的酶学性质的测定 | 第48-56页 |
| ·K6的获得 | 第48页 |
| ·不同溶液对K6酶活性的影响 | 第48-49页 |
| ·K6在不同缓冲液下的酶活 | 第49页 |
| ·K6的最适反应温度 | 第49-50页 |
| ·K6的最适pH | 第50-51页 |
| ·K6的最适NaCl浓度 | 第51页 |
| ·K6的热稳定性的测定 | 第51页 |
| ·pH对K6稳定性的影响 | 第51-52页 |
| ·Ca~(2+)对K6酶活性的影响 | 第52-53页 |
| ·金属离子对K6酶活性影响 | 第53页 |
| ·不同底物与K6反应 | 第53-54页 |
| ·HPLC分析K6水解淀粉产物 | 第54-55页 |
| ·K6的比活力的测定 | 第55页 |
| ·K6的Vmax和Km值 | 第55-56页 |
| ·嗜盐性淀粉酶嗜盐机制的研究 | 第56-61页 |
| ·嗜盐淀粉酶用SWISS-MODEL空间建模 | 第56页 |
| ·选择突变位点 | 第56-59页 |
| ·K6突变位点的选择 | 第56-57页 |
| ·F2突变位点选择 | 第57-59页 |
| ·反向PCR扩增k7、f3 | 第59页 |
| ·突变酶的SDS-PAGE | 第59-60页 |
| ·突变酶的活力比较 | 第60-61页 |
| 第四章 讨论 | 第61-65页 |
| ·嗜盐性的α-淀粉酶 | 第61页 |
| ·嗜盐α-淀粉酶性的序列比对 | 第61-62页 |
| ·盐性α-淀粉酶其嗜盐特性的研究 | 第62-65页 |
| 第五章 结论与展望 | 第65-67页 |
| ·结论 | 第65-66页 |
| ·问题和展望 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-76页 |
| 附录1 | 第76-79页 |
| 附录2 | 第79-82页 |
| 附录3 | 第82-83页 |
| 附录4 | 第83-85页 |
| 致谢 | 第85-86页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 | 第86页 |
