| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第11-12页 |
| 1 文献综述 | 第12-18页 |
| ·副猪嗜血杆菌相关毒力因子及致病机理研究 | 第12-13页 |
| ·Ⅳ型菌毛 | 第13-16页 |
| ·巴氏杆菌科中关于Ⅳ型菌毛的研究 | 第16-18页 |
| 2 研究目的及意义 | 第18-19页 |
| 3 材料和方法 | 第19-38页 |
| ·实验材料和试剂 | 第19-23页 |
| ·菌株、细胞和质粒 | 第19-20页 |
| ·相关酶、抗体及试剂盒 | 第20页 |
| ·主要培养基、材料及配制 | 第20-21页 |
| ·相关试剂及配制 | 第21-23页 |
| ·抗生素的配制 | 第21页 |
| ·ELISA相关试剂及配制 | 第21页 |
| ·SDS-PAGE及Western blot相关试剂的配制 | 第21-22页 |
| ·其它试剂的配制 | 第22-23页 |
| ·引物 | 第23页 |
| ·实验动物及其它材料 | 第23页 |
| ·实验仪器 | 第23页 |
| ·实验方法 | 第23-38页 |
| ·克隆菌毛操纵子的序列 | 第23-28页 |
| ·细菌培养 | 第23-24页 |
| ·细菌基因组的提取 | 第24页 |
| ·PCR克隆菌毛基因 | 第24-25页 |
| ·酶切鉴定并回收连接PCR产物 | 第25-26页 |
| ·连接产物转化 | 第26-27页 |
| ·质粒的小量提取和鉴定 | 第27-28页 |
| ·蛋白的原核表达、纯化与检测 | 第28-30页 |
| ·PCR扩增pilA基因 | 第28页 |
| ·PCR产物的回收、连接与转化 | 第28-29页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第29页 |
| ·蛋白表达与纯化 | 第29-30页 |
| ·蛋白PilA的多克隆抗体制备 | 第30-31页 |
| ·动物免疫 | 第30页 |
| ·间接ELISA方法检测血清效价 | 第30-31页 |
| ·电镜观察不同生长环境下的HPS | 第31-32页 |
| ·HPS的培养 | 第31页 |
| ·细菌与细胞互作实验 | 第31页 |
| ·鸡胚内传代HPS | 第31-32页 |
| ·电镜观察样品的制备 | 第32页 |
| ·Western blot验证PilA为体内诱导表达蛋白 | 第32页 |
| ·pilA缺失突变株的筛选 | 第32-38页 |
| ·PCR扩增pilA的上下游同源臂 | 第32-33页 |
| ·PCR产物的回收、连接 | 第33-34页 |
| ·连接产物的电转化 | 第34-36页 |
| ·转化子的质粒提取及鉴定 | 第36页 |
| ·利用温敏质粒pSHK3TS-UD筛选突变株 | 第36-37页 |
| ·单交换的鉴定 | 第37页 |
| ·双交换的鉴定 | 第37-38页 |
| 4 实验结果与分析 | 第38-51页 |
| ·克隆并分析菌毛操纵子的序列 | 第38-42页 |
| ·序列同源性分析 | 第38-39页 |
| ·启动子序列的分析 | 第39-40页 |
| ·结构基因pilA的序列分析 | 第40-42页 |
| ·PilA蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备 | 第42-45页 |
| ·pilA的克隆及表达质粒的构建 | 第42-43页 |
| ·PilA蛋白的原核表达及纯化 | 第43-44页 |
| ·蛋白PilA多克隆抗体的制备 | 第44-45页 |
| ·Western blot验证PilA蛋白 | 第45页 |
| ·电镜观察HPS SH0165 | 第45-47页 |
| ·实验室培养条件下观察菌毛的存在情况 | 第45-46页 |
| ·观察体内分离的HPS的菌毛存在情况 | 第46-47页 |
| ·SH0165与PK-15细胞互作后电镜观察 | 第47页 |
| ·SH0165鸡胚内传代后的电镜观察 | 第47页 |
| ·Western blot验证PilA为体内诱导表达蛋白 | 第47-48页 |
| ·实验室培养SH0165中pilA的表达 | 第47-48页 |
| ·验证pilA基因的体内表达 | 第48页 |
| ·pilA突变株的筛选 | 第48-51页 |
| ·温敏型穿梭质粒的构建 | 第48-49页 |
| ·pilA上下同源臂的克隆及重组质粒的构建 | 第49-50页 |
| ·缺失突变株的筛选 | 第50-51页 |
| 5 讨论 | 第51-54页 |
| ·菌毛操纵子的序列分析 | 第51-52页 |
| ·HPS菌毛表达条件的探索 | 第52页 |
| ·蛋白PilA为体内诱导表达蛋白 | 第52页 |
| ·温敏型突变系统有待改进 | 第52-54页 |
| 6 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-58页 |
| 致谢 | 第58页 |
